абстрактно
Генът на активин тип II рецептор (ACTRII) е мутирал в 58,1% от микросателитните нестабилни (MSI-H) колоректални карциноми и е близък роднина на рецептора от тип II TGFβ-1, за който е известно, че участва в MSI-H и не - MSI-H колоректална канцерогенеза. Следователно ние се опитахме да определим дали ACTRII участва в колоректален рак, който не е MSI-H. Оценихме ACTRII инактивация чрез алелно делеция, загуба на експресия на иРНК или соматична мутация при 51 не-MSI-H карциноми на дебелото черво. Загуба на хетерозиготност (LOH) в локуса ACTRII (2q23.1) е установена при 9 (17,6%) 51 първични тумора. Загуба на експресия на ACTRII тРНК се наблюдава при един (14,3%) от седем положителни за LOH първични тумори, от които е налична обща РНК. Извършихме също анализ на ДНК последователност на тумори, показващи LOH. Един първичен LOH-позитивен тумор показва промяна на зародишната линия (заместване на аминокиселина, 117 Ile към Phe), която не е била открита при 23 други нормални индивида, което показва, че тази промяна не е общ полиморфизъм. Ние заключаваме, че ACTRII вероятно участва в колоректалната канцерогенеза на не-MSI-H и MSI-H, но по-често във втората подгрупа.
Основното
Колоректалният рак е втората водеща причина за смъртни случаи, свързани с рака, в Съединените щати и третата по честота рак при двата пола, със 135 400 нови случая и 56 700 смъртни случая през 2001 г. (American Cancer Society, 2001). Следователно е от съществено значение да се открият и разберат по-добре молекулните пътища, лежащи в основата на този вид рак, включително идентифицирането на нови гени на супресор на тумора, както и механизмите, свързани с тяхното инактивиране.
Генът на активен рецептор тип II (ACTRII) е идентифициран чрез мутационен скрининг на мутации в целия геном като нов кандидат туморен супресорен ген, мутирал много често (при 58,1% MSI-H колоректални карциноми, т.е. тумори с висока микросателитна нестабилност) при (A ) 8 мононуклеотиди се повтарят в неговия кодиращ регион (Mori et al, 2001). ACTRII е член на семейството на трансформиращия фактор на растежен фактор β (TGF-β) и е свързан със сигналния път на активин-SMAD, който от своя страна участва в индуцирането на диференциация, потискане на растежа и апоптоза в различни клетъчни типове, включително тези, получени от чревен епител. (Attisano et al, 1996; Sonoyama et al., 2000). Нарушаването на сигналния път ACTRII инхибира диференциацията на клетките in vitro (Li et al., 1998; Liu et al., 2000) и апоптозата (Chen et al., 2000; Choi et al., 2001). Сигнализиращият път TGF-β-SMAD, който споделя низходящите ефектори SMAD2 и SMAD4 с активин-SMAD пътя, е отговорен за супресията на човешкия тумор (Attisano et al., 1996; Liu et al., 2000; Sonoyama et al., 2000; Su и др., 2001). ACTRII образува активен комплекс от хетеродимерни рецептори с ACTRI (Attisano et al, 1993). Интересното е, че наскоро соматичната мутация ACTRI е описана при рак на панкреаса (Su et al, 2001).
За да определим дали ACTRII участва във всички колоректални тумори, а не в тези, които имат честа микросателитна нестабилност, ние изследвахме ACTRII инактивирането при не-MSI-H тумори. Проведохме подробна загуба на хетерозиготност (LOH) 2q22.1-q23.3 проучвания, регион, съдържащ ген ACTRII, в 51 колоректални тумора, които не са MSI-H. LOH-положителните тумори бяха допълнително тествани за соматични точкови мутации в ACTRII .
резултатът
Алелотипирането показа, че 17 (33%) 51 колоректални тумора показват LOH в един или повече от четирите локуса на хромозома 2q23.1. Тези резултати са обобщени в Таблица 1. Локус D2S141 показа най-високата степен на LOH (12 от 27 информативни случая или 44,4%). Девет (17,6%) от 51 тумора са имали LOH, фланкиращ локуса ACTRII: те включват 7 аденокарциноми и 2 аденоми, единият от които съдържа висококачествена фокална дисплазия.
Маса в пълен размер
Количествената RT-PCR показа, че на един тумор напълно липсва експресия на ACTRII иРНК (Фиг. 1). Тази констатация е потвърдена от няколко повторни теста. ДНК секвенирането на останалите шест тумора, от които е налична РНК, разкри, че тя съдържа единична нуклеотидна промяна (TTT до ATT, заместване на аминокиселина Ile към Phe) при кодон 117 в извънклетъчния домейн на ACTRII. Тази промяна на последователността също се появи в съответната нормална проба (Фиг. 2). В допълнение, тихият полиморфизъм при кодон 118 (CCG до CCA) е открит в 3 (50%) от 6 първични туморни проби; Установено е, че този полиморфизъм е описан по-рано (D'Abronzo et al, 1999). Този полиморфизъм се наблюдава и при пет (62,5%) от осемте колоректални клетъчни линии, които изследвахме (D'Abronzo et al, 1999). И накрая, сред тези осем клетъчни линии открихме заличаване на една база в повторение (А) 8 при кодон 437 в SW48 клетки, за които е известно, че са MSI-H (Branch et al, 1995).
Експресия на ACTRII ген в тумори на LOH. RT-PCR анализ на загуба на хетерозиготност (LOH) + проби. Това изображение показва гел изображение на RT-PCR продукта за седем LOH-положителни тумори. Резултатите за β-актин RT-PCR са представени като вътрешен контрол. RT-PCR се извършва съгласно протокола Invitrogen/Life Technologies. PCR условията са описани по-рано (Mori et al., 2001). Най-отгоре, 1100-bp фрагмент на гена ACTRII; dna, 436-bp RT-PCR продукт на гена на β-актин. Линия 6 представлява пълна липса на експресия на mTRK на гена ACTRII .
Изображение в пълен размер
Промяна на последователността на зародишните линии в ACTRII. Промяна на нуклеотида при кодон 117. Промяна на нуклеотид от нормална Т (вляво) в А (вдясно) при кодон 117, в резултат на промяна на аминокиселина от Ile към Phe в извънклетъчния домейн на рецептора. Цифрите показват смисловата последователност и кодон 117 е посочен и в двата панела. Стрелката показва мутиралия нуклеотид.
Изображение в пълен размер
дискусия
ACTRII често се мутира при MSI-H колоректален рак (Mori et al, 2001). Освен това е известно, че активинът играе роля в растежа и диференциацията на чревните клетки (Attisano et al., 1996; Sonoyama et al., 2000). И накрая, съществуват силни структурни и функционални прилики между активин и TGF-β рецепторите (Attisano et al., 1993), за последния от които е известно, че участват както в MSI-H, така и в не-MSI-H колоректална туморогенеза (Calin et al. al., 2000; Grady et al., 1998, 1999; Orimo et al., 1998). Поради тези причини изследвахме соматични промени в гена ACTRII при колоректален рак без MSI-H. Появата на алелна делеция при 2q23.1 при два аденома (единия с фокална дисплазия), както и при седем аденокарциноми, предполага, че LOH в този локус може да възникне в началото на колоректалната неоплазия.
За да оценим дали заличаването на един ACTRII алел е свързано с инактивиране на останалия алел, ние извършихме ДНК секвениране на целия ACTRII кодиращ регион в седем LOH-позитивни първични тумора, от които беше налична РНК, както и в осем колоректални ракови клетки. линии. Този мутационен анализ разкрива, в допълнение към тихия полиморфизъм при кодон 118 в пет от осемте клетъчни линии и три от шестте тумора, експресиращи ACTRII, единственият пациент с нова промяна при кодон 117 в тумора и в съответните нормални проби.
По-специално, промяната на кодон 117 (I117F), открита в един първичен тумор, не е описана преди това. За да определим дали I117F представлява мутация на зародишна линия или полиморфизъм, ние секвенирахме нормална геномна ДНК от 23 други индивида, фокусирайки се върху втория екзон на гена ACTRII (съдържащ кодон 117). Нито един от тези индивиди не е имал тази промяна, което предполага, че I117F не е често срещан полиморфизъм в общата популация.
За да се изследва участието на ACTRII кодон 117 в човешката туморогенеза като цяло, извършихме търсене на литература. Известно е, че три аминокиселини в извънклетъчния домейн на ACTRII, 42F, 60W и 83F участват в свързването на активин и инхибин с ACTRII: мутациите на тези остатъци в рецептора с пълна дължина причиняват нарушаване на свързването на активин и инхибин (Gray et al, 2000).
Пълна липса на експресия на мРНК на ACTRII е установена в един от седемте положителни за LOH положителни първични не-MSI-H тумори, но в нито една от осемте клетъчни линии на колоректалния рак. Възможно е хиперметилирането на промотора да е причинило тази липса на експресия; въпреки това, промоторният регион за ACTRII не може да бъде идентифициран в публични бази данни на ДНК последователности, нито CpG острови нагоре по веригата са открити в геномния локус ACTRII. И накрая, мутация на кодон 437, водеща до прогнозирания пресечен протеин, се наблюдава в SW48, единствената изследвана клетъчна линия на колоректалния карцином, MSI-H.
Тези данни предполагат, че генетични промени в гена ACTRII (т.е. миссенс мутация, пълна загуба на иРНК и експресия на LOH) се появяват при колоректален рак, който не е от MSI-H, но с по-ниска честота, отколкото при рак на MSI-H. По този начин, събития, за които се смята, че водят до инактивиране на ACTRII, се случват както при MSI-H, така и при не-MSI-H колоректални тумори, като допълнително подкрепят кандидатурата на ACTRII като ген за подтискане на колоректален тумор.
Материали и методи
Подготовка на тъкани, екстракция на ДНК и РНК
Петдесет и един колоректални карциноми без MSI-H, които показват MSI в не повече от едно от петте консенсусни места (BAT 25, BAT 26, D2S123, D5S346 и D17S250) са получени със съответните нормални контролни тъкани. Всички проби бяха взети по време на операция или ендоскопия и незабавно замразени в течен азот. ДНК и РНК бяха извлечени от замразени тъканни проби, използвайки DNeasy Tissue Kit и RNeasy Mini Kit от Qiagen (Валенсия, Калифорния), съгласно протокола на производителя.
Анализ на разпределението
Четири микросателитни маркера, разположени в 17-Mb регион на 2q22.1-q23.3, включително гена ACTRII (2q23.1), бяха използвани за проучването LOH: D2S127, D2S151, D2S2299 и D2S141 (Таблица 2). Генът ACTRII се намира между D2S151 и D2S2299. PCR реакциите се провеждат в общ обем от 10 μl, съдържащ 20 ng геномна ДНК, 0,5 μm от всеки праймер, 1 x Taq полимеразен буфер (Life Technologies, Gaithersburg, Maryland), 0,1 mm всеки от dNTPs, 1,5 mm MgCl и 0, 1 IU Taq ДНК полимераза (Life Technologies). PCR условията са описани по-рано (Mori et al., 2001). Десет микролитра от всеки PCR продукт бяха анализирани на автоматизиран ДНК секвенсор (MegaBace 1000; Amersham LifeSciences/Molecular Dynamics, Сънивейл, Калифорния), използвайки софтуер Genetic Profiler, версия 1.0 (Amersham Life Sciences/Molecular Dynamics). Класифицирахме специфичната за тумора промяна като LOH, когато тя доведе до промяна от повече от 50% от височината на пика на туморния алел в сравнение със съответната нормална стойност.
Маса в пълен размер
Мутационни анализи
RT-PCR за нива на експресия и cDNA секвениране.
РНК се предлага от седем LOH-позитивни тумори, както и от осем клетъчни линии на колоректален рак (SW480, SW48, Colo320HSR, WiDr, SW620, SW948, Colo201 и Colo32DM). Обратната транскрипция използва 10 μg обща иРНК в общ реакционен обем 20 μl, съдържащ 0,5 μg Oligo dT (Invitrogen, Carlsbad, CA), 0,1 mm dNTP смес (Invitrogen), 4 μl 5x буфер от първа нишка (пак там) μl 0,1 m дитиотреитол (Invitrogen) и 1 μl инхибитор на рекомбинантна рибонуклеаза RNase OUT 40 U/μl (Invitrogen). Протоколът PCR се извършва в общ обем от 20 μl, съдържащ 1,75 μl праймер (Invitrogen), 0,1 mm dA/T/C/GTP, 0,1 μl ДНК полимераза Taq (Qiagen) и 10x Taq полимеразен буфер (Qiagen). при същите условия, както са описани в анализа на алелотипа. Вътрешният RT-PCR контрол за гена β-актин се състои от същия протокол, с праймери 5 Index-IndexTerm IndexTerm CCA GAG CAA GAG AGG TAT CC-3 ′ и 5′-IndexTerm IndexTerm CTG TGG TGG TGA AGC TGT AG-3 ". Електрофорезата на PCR продукта се извършва върху 1,5% агарозен гел. Анализът на последователността беше извършен както на смислени, така и на антисмислени вериги на cDNA, получени чрез RT-PCR.
Анализ на CDNA последователност.
Последователните реакции бяха проведени с помощта на комплект терминатор DYEnamic ET (Amersham Pharmacia Biotech) съгласно протокола на производителя. Електрофорезата се извършва на инструмент MegaBace 1000 (Molecular Dynamics) и се анализира с помощта на софтуера Sequence Analyzer, версия 2.0 (Amersham Pharmacia Biotech). ДНК последователностите от тумори или клетъчни линии бяха сравнени с дивия тип ACTRII последователност, получена от базата данни на Националния център за биотехнологична информация (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov). Геномна ДНК от 24 колоректални рака беше секвенирана на втория екзон на гена ACTRII съгласно протокола, описан по-горе, като се използваха праймери 5'-IndexTerm IndexTerm TTC TCT GCT TAT TTA TAG GAC TG-3 'и 5'-IndexTermTTTTTTTTTT TCC AAT CTA CAG TTG AGC -3 ′.
Благодаря
Тази работа беше частично подкрепена от безвъзмездни средства DK47717, CA95323, CA85069 и CA63670 и CA77057.