променя

  • елементи
  • абстрактно
  • цели да:
  • Предмети и методи:
  • резултатите:
  • заключение:
  • Въведение
  • резултатът
  • Изразяването на човешки SP1 увеличава телесното тегло на мухите
  • SP1 увеличава съхранението на мазнини при трансгенни мухи
  • SP1 увеличава приема на храна, но не влияе върху двигателната активност.
  • Трансгенните мухи SP1 бяха устойчиви на недостиг на храна и намалени експресия на липин ген
  • дискусия

елементи

  • Дрозофила
  • Генната експресия
  • Затлъстяване
  • патогенеза
  • Поправка на тази статия е публикувана на 11 декември 2012 г.

абстрактно

цели да:

Патогенезата на затлъстяването все още остава напълно неразбрана. Дрозофилата е запазила невроендокринната и храносмилателната системи при хората и се е превърнала в отлична система за изучаване на енергийната хомеостаза. Въведохме нов модел на затлъстяване дрозофила, при който експресията на човешкия протеин синфилин-1 (SP1) в невроните насърчава положителен енергиен баланс.

Предмети и методи:

За по-нататъшно разбиране на ефекта на SP1 при контролиране на енергийния баланс, системата за активиране на последователността нагоре по веригата UAS/GAL4 се използва за генериране на човешка SP1 трансгенна дрозофила. Характеризирахме човешката трансгенна дрозофила SP1 чрез определяне на експресия на SP1, съхранение на мазнини, прием на храна и локомоторна активност на мухата, за да определим основните поведенчески промени и техните последици за развитието на подобен на затлъстяване фенотип.

резултатите:

Свръхекспресията на SP1 в невроните, но не и в периферните клетки, увеличи телесното тегло на мухите в сравнение с нетрансгенните контроли. SP1 увеличава приема на храна, но не влияе върху двигателната активност. SP1 увеличава нивата на триацилглицерола и размера на мастните клетки и мастните капчици, което предполага, че SP1 увеличава разпределението на мазнините и мазнините. Проучванията за оцеляване показват, че трансгенните мухи SP1 са по-устойчиви на недостиг на храна. SP1 регулира експресията на липинов ген, който може да участва в SP1-индуцирано отлагане на мазнини и резистентност на гладно.

заключение:

Тези проучвания показват, че експресията на SP1 влияе на енергийната хомеостаза по начини, които увеличават положителния енергиен баланс и осигуряват полезен модел на затлъстяване за бъдещи патогенни и терапевтични изследвания.

Дрозофилата се превърна в отличен модел за изучаване на хомеостазния метаболизъм и пътищата на чувствителност към хранителни вещества. 17, 18 Дрозофила е запазила гръбначноподобни невроендокринни и храносмилателни системи. Дрозофилата и хората използват аналогични системи от органи и биохимични пътища, за да поддържат нивата на циркулиращата захар и да съхраняват захари и мазнини. Гликогенът и мазнините (най-вече като триацилглицероли (TAG)) се съхраняват в мастни мухи, които могат да се считат за еквивалент на муха на черния дроб и бялата мастна тъкан. Сърдечната система на насекомото Pars intercerebralis-corpora, ендокринологичният еквивалент на хипоталамо-хипофизната жлеза на гръбначните животни, получава информация за вътрешното метаболитно състояние и координира физиологичните дейности на различни периферни органи. Дрозофилните модели се използват за изследване на няколко аспекта на енергийната хомеостаза, включително възприемане на храна, контрол на приема на храна, енергиен поток и липометаболизъм. 17, 18 Въпреки че молекулярната основа за регулиране на метаболитната хомеостаза далеч не е разбрана, изучаването на това как новите протеини действат, за да повлияят на метаболитните реакции като липидна и глюкозна хомеостаза може да отвори нови възможности за разбиране на цялостния контрол на енергийния баланс и идентифициране на потенциални нови терапевтични средства.

За по-нататъшно изследване на ефектите на SP1 в енергийния баланс, ние генерирахме човешки трансгенни модели на Drosophila SP1, използвайки последователността за активиране нагоре по веригата на системата UAS/GAL4, за да предизвика експресия на SP1 в различни тъкани на ларви и възрастни мухи. В Drosophila няма ортолог на човешкия ген SP1. По този начин, трансгенната дрозофила е идеална система за изследване на ефектите на човешкия SP1. В това проучване изследвахме ефектите от експресията на човешкия SP1 в различни мухоневрони, които регулират енергийния баланс, включително фетуси без gal4, допаминергични, серотонергични и пан неврони. Също така оценихме ефектите от експресията на човешки SP1 в мастните тела и клетките за секреция на инсулинов пептид при мухите. Измерихме съхранението на мазнини, телесното тегло и приема на храна, за да оценим ефектите от SP1.

резултатът

Изразяването на човешки SP1 увеличава телесното тегло на мухите

Системата UAS/GAL4 е използвана за генериране на човешки SP1 трансгенни мухи. 25, 26 В тази система транскрипционният фактор на дрожди GAL4 се свързва конкретно с UAS. По този начин, свързаните с UAS трансгени могат да бъдат експресирани в специфични клетъчни типове под контрола на даден промотор (GAL4 промотор). Този наскоро разработен метод за целенасочена интеграция се използва за преодоляване на ефекта от позиционирането на трансгени и за получаване на високи нива на експресия. 19, 20 Принципът на този метод е, че използването на изолатор на цигански ретровирус надеждно произвежда силно експресирани трансгени в различни тъкани. За да бъдат ефективни, циганските трансгени трябва да бъдат насочени към специфични места, като attP, за да се постигнат най-високи нива на индукция и да се използват заедно с неутрални ядрени промотори, за да се гарантира строга базална регулация. Човешкият SP1 ген е клониран в UAS-attB вектор, съдържащ attB място (Фигура 1а). Получената конструкция се инжектира съвместно с phiC31-интегразна РНК, за да лети през зародишната линия (attP40), съдържаща местата за кацане на attP, както е описано по-рано. 19, 20 Полетната линия на UAS-SP1 е създадена чрез генетично картографиране.

SP1 увеличава съхранението на мазнини при трансгенни мухи

TAG и гликогенът са основните вътреклетъчни форми на съхранена енергия в мухите. 17, 18 При възрастни мухи, експресията на човешки SP1 в допаминергичните неврони значително увеличава съдържанието на TAG (Фигури 2а и b), но не променя съдържанието на гликоген (Фигура 2в). За по-нататъшна оценка дали експресията на SP1 в допаминергичните неврони увеличава съхранението на мазнини в развитието, използвахме плаващ тест, индиректен тест за телесно съдържание на мазнини в ларви на дрозофила, базиран на индивиди с по-високо съдържание на мазнини, плуващи по-добре в разтвор от фиксирана плътност от бедни индивиди - по-висока плътност на плаваемост на мастните ларви, причиняваща по-висока скорост на плуване в 9% разтвор на захароза. Когато ларвите се потопят в 9% разтвор на захароза, повечето нетрансгенни мухи намаляват, докато ларвите на ddc-GAL 4 намаляват; UAS-SP1 животни плуваха (Фигура 3а). Степента на подвижност на ларвите на VD при животни ddc-GAL4, UAS-SP1 и нетрансгенни контроли са съответно 71% и 6% (Фигура 3b).

Синфилин-1 повишава TAG и гликоген при възрастни мухи. Възрастни нетрансгенни и ddc-GAL4 хомогенати; Трансгенните мухи UAS-SP1 на 10-дневна възраст бяха тествани за TAG ( а, б ) или гликоген ( ° С ). Нивата на триацилглицерол и гликоген са нормализирани до нива на протеин и са представени спрямо нивото при нетрансгенни контролни мухи (pUASTattb-синфилин-1). Тук грешките представляват независими независими проби от 40 животни от всяка група; * Р

Синфилин-1 увеличава съхранението на мазнини в третия етап на ларвите. ( а, б ) SP1 увеличава отлагането на мазнини при ларви от трета степен, използвайки тест за плътност, базиран на плаваемост. Нетрансгенните ларви и ларвите SP1 се потапят в 9% разтвор на захароза в пластмасови кювети и се снимат след достигане на равновесие. а ) Снимки на плаващи тестове. ( б ) За посочените генотипове средният резултат за флотация (% от плаващи ларви) е изчислен от три независими повторения, като се използва за всеки експеримент

20 ларви, потопени в захароза. Лентите за грешки представляват * P 17, 18, защото този орган на бозайник липсва в насекомите. Мастното тяло функционира като изпълнителен орган за съхранение и мобилизиране на енергия в контрола на енергийния баланс в отговор на хуморалните сигнали на мозъчната невроендокринна система. Мастното тяло на ларвата се състои от определен брой големи полиплоидни клетки, образуващи един съседен лист на орган, който се простира през телесната кухина и реагира на излишните хранителни вещества чрез хипертрофия. Тези полиплоидни клетки са съставени предимно от липидни капчици (пълни с трофоцити). Размерът на мастните клетки се увеличава значително при ларвите, експресиращи човешки SP1 в допаминергичните неврони в сравнение с нетрансгенните контроли (Фигури 3в и d). Размер на мастните клетки в ларвите на ddc-GAL; Мухите на UAS-SP1 са се увеличили приблизително два пъти. В допълнение, размерът на липидните капчици също се е увеличил при тези SP1 трансгенни ларви в сравнение с нетрансгенните контроли (Фигура 3д). Въпреки това, дължината на тялото на ларвите не се е променила с експресията на SP1 (Фигура 3f).

SP1 увеличава приема на храна, но не влияе върху двигателната активност.

За да се оцени дали експресията на SP1 променя калорийния прием при мухите, CAFÉ анализите се използват за измерване на приема на храна за възрастни мухи във всички трансгенни линии, които са имали повишено телесно тегло. Невроналната експресия на SP1 значително увеличава приема на храна в трансгенни линии в сравнение с нетрансгенните контролни мухи (Фигури 4а и b). Тестовете за изкачване и измерванията на актометъра бяха използвани за наблюдение на двигателната активност на мухите като заместител на разхода на енергия. Няма разлики в тестовете за катерене между ddc-Gal4, UAS-SP1 и нетрансгенни контролни мухи на всяка възраст (Фигура 4в). За по-нататъшна оценка дали SP1 промените променят цялостната активност, ние използвахме тест на актометър, за да оценим модел на движение при 10-дневни мухи по време на 12-часов тъмен/12-часов цикъл. Мухите показаха два пика на активност. Експресията на SP1 в допаминергичните неврони не повлиява времената или честотата, при които е настъпила максимална активност или обща локомоторна активност (Фигура 4г).

Синфилин-1 увеличава приема на храна при възрастни мухи. ( а, б ) Тестът CAFÉ се използва за наблюдение на приема на 5-дневна муха в продължение на 1 до 5 дни. Записва се дневният прием на храна за всяка муха. Данните са средно ± sem ( а ) дневен прием на храна; б ) кумулативен прием на храна за 48 часа. Значителни разлики между SP1 трансгенни мухи и нетрансгенни контролни мишки, както е посочено, * P

Експресията на SP1 в невроните на мухи значително увеличава приема на храна в сравнение с нетрансгенните мухи. Експресията на SP1 обаче не променя двигателната активност, което предполага, че именно SPf-индуцираната хиперфагия води до увеличаване на теглото и увеличаване на съхранението на мазнини. Тези резултати са в съответствие с предишните ни открития в човешки SP1 трансгенен миши модел 16, при който експресията на човешки SP1 в неврони увеличава приема на храна, телесното тегло и телесните мазнини. Двойното хранене на SP1 трансгенни мишки с количеството храна, консумирано от нетрансгенната мишка в продължение на 10 седмици, нормализира фенотипите на затлъстяването, доказвайки, че затлъстяването е вторично за увеличения прием на храна.

В обобщение, ние демонстрираме, че експресията на човешки SP1 при невронни мухи е причинила подобни на затлъстяване фенотипове, включително наддаване на тегло, телесни мазнини (съдържание на TAG), прием на храна и глад. Тези фенотипове са най-изразени при трансгенни мухи, когато SP1 се експресира в допаминергични неврони. SP1 увеличава размера на мастните тела и липидните капчици, намалява експресията на липинен ген и намалява скоростта на движение на ларвите в захарозата. Нашите открития показват, че експресията на SP1 положително регулира енергийната хомеостаза. Тези резултати също така предоставят полезен нов модел за по-нататъшно разбиране на патогенезата на затлъстяването и за разработване на нови лекарства за профилактика и интервенция на затлъстяването.