ревящата

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Разграждане на кофеина през H. hampei
  • Биогеографски анализ на микробиома H. hampei
  • Кофеин-разграждащи бактерии в червата H. hampei
  • Кислородни профили в червата H. hampei
  • Възстановяване на разграждането на кофеина през H. hampei
  • дискусия
  • методи
  • Проби от насекоми
  • ДНК екстракция, PCR амплификация и високоефективно секвениране
  • Анализ на 16S рРНК гени
  • Изолиране на разграждащи кофеина бактерии и тяхното идентифициране
  • Генен скрининг ndmA в изолати и H. hampei
  • O 2 измервания с помощта на микроелектроди
  • Време за диетично преминаване през H. hampei
  • Антибиотично лечение и реинфекция
  • Откриване на кофеин в проби от фрас
  • Ефект на антибиотиците върху репродукцията H. hampei
  • стъпки
  • GenBank/EMBL/DDBJ
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • видеоклипове
  • Допълнителен филм 1
  • Excel файлове
  • Допълнителна информация 1
  • Коментари

елементи

  • ентомология
  • Микробна екология
  • микробиом

абстрактно

Свредлото за кафе с горски плодове (Hypothenemus hampei) е най-разрушителният вредител на насекомите в света, заразява насекомите и намалява добива им с до 80%. Кофеинът е алкалоид, който може да бъде токсичен за насекомите и се смята, че действа като защитен механизъм, който инхибира тревопасното животно. Тук показваме, че кофеинът се разгражда в червата на H. hampei и че експерименталното инактивиране на чревната микробиота елиминира тази активност. Ние показваме, че чревните микробиоти в екземпляри от H. hampei от седемте големи страни производителки на кафе и колонии, отглеждани в лаборатории, споделят ядрото на микроорганизмите. Повсеместни членове на чревната микробиота, включително видни видове Pseudomonas, живеят на кофеин като единствен източник на въглерод и азот. Гените на Pseudomonas кофеин деметилаза се експресират in vivo в червата на H. hampei, а реваксинацията на лекувани с антибиотици насекоми с изолиран щам Pseudomonas възстановява способността за разграждане на кофеина, потвърждавайки тяхната ключова роля.

При насекомите, както и при други животни, разграждането на кофеина може да бъде катализирано от цитохром Р450 ензими 20, 21. Не се съобщава обаче за други метазоани, които да издържат на концентрациите на кофеин, на които е изложен H. hampei, като същевременно оцеляват и завършват целия си жизнен цикъл изключително върху зелените кафе на зърна. Ние предположихме, че разграждането на кофеина в H. Hampei се медиира предимно от активността на чревната му микробиота. Тук представяме първото изследване на микробиома на H. hampei и неговата роля за детоксикацията на кофеина при насекомите. Нашето откритие на микробния компонент за трансформацията на кофеина и съществуването на H. hampei върху кафените зърна има важни последици за разбирането на метаболизма и екологията на този голям вредител.

резултатът

Разграждане на кофеина в H. hampei

За да проверим хипотезата, че разграждането на кофеина е микробно медииран процес в H. hampei, получихме проби от седем географски диспергирани региони за производство на кафе: Кения (Киамбу), Индонезия (Източна Ява), Индия (Карнатака), Пуерто Рико (Аджантас), Хаваи. (Kona), Гватемала (Coatepeque) и Мексико (Chiapas). Образците от Индия включват насекоми, взети от двата доминиращи вида Coffea (C. arabica и C. canephora). Използвахме също лабораторно подпомогнати колонии, първоначално от колумбийската популация на H. hampei и три други вида ракообразни, които не могат да живеят с кафе на зърна (H. crudiae, H. eruditus и Scolytodes maurus).

Първо тествахме разграждането на кофеина след преминаване през червата на насекомите и установихме дали чревната микробиота е отговорна за този процес. Тази хипотеза беше тествана с помощта на колония на H. Hampei в лаборатория, отгледана в контролиран експеримент, използвайки изкуствена диета (наричана тук минимална диета), съдържаща зелено кафе на зърна от C. arabica с крайна концентрация на кофеин 8 1,8-2,2 mg -1. Проби от Hypothenemus hampei бяха въведени във флакони, съдържащи тази определена диета и показаха типична скучна активност (допълнителен филм 1) и производство на фракции. Количеството консумирана храна и времето на престой на храната в храносмилателния тракт на H. hampei се определят чрез включване на флуоресцентни сферични индикатори в диетата. Времето за престой обикновено е 3 часа (допълнителна фигура 1) и съответства на теглото

Маса в пълен размер

а ) Експериментално проектиране и анализ на концентрациите на кофеин в пробата на H. hampei в контролната проба и за антибиотици. Антибиотично медиирано изчерпване на микробиома H. Hampei елиминира трансформацията на кофеин и увеличава секрецията на кофеин. б ) FTIR профили за чист кофеин (черен), контрол (насекоми без антибиотици - червено) и третиран с антибиотик фрагмент от насекоми (зелен). Показаните профили представляват средната стойност на всички измервания (n = 6).

Изображение в пълен размер

Биогеографски анализ на микробиома на H. hampei

За да идентифицираме членовете на чревната бактерия H. hampei, които могат да допринесат за разграждането на кофеина, ние анализирахме бактериалния състав на микробните съобщества на H. hampei, използвайки 16S rRNA генно секвениране от проби от основните региони за производство на кафе (допълнителни данни 1). Филогенетичното β-разнообразие и йерархичното групиране показват разделянето на микробите според географския произход (Допълнителна фигура 4). Използван е непараметричен пермутационен анализ на многомерно разсейване, за да се разпредели дисперсията в микробния състав между ключовите фактори. Географското местоположение обяснява голяма част от дисперсията (45%) на бактериалния състав (допълнителна фигура 4). На места, където видовете кафе варират (Индия; C. arabica и C. canephora), видовете кафе представляват 78% от вариацията в микробния състав. Въпреки че доминиращите микробни таксони също се променят географски, мрежовият анализ показва ядрото на организмите, открито на всички места (фиг. 2а). Тези организми са свързани, inter alia, с сериите Pseudomonadales, Enterobacteriales, Turicibacteriales, Rhizobiales, Alteromonadales, Actinomycetales; като има предвид, че псевдомонадалите са били много разпространени във всички взети проби (фиг. 2б).

а ) Филогенетичен мрежов анализ, показващ доминиращи бактериални групи, свързани с проби от H. hampei от седемте основни страни производителки на кафе. Насекомите от Мексико включват и насекоми от видове, различни от H. hampei. ◊, H. hampei, - S. maurus; A, H. crudiae; □, H. eruditus . б ) Акции на Pseudomonas spp. последователности в микробиома на събраните проби.

Изображение в пълен размер

Кофеин-разграждащи бактерии в червата на H. hampei

а ) Кофеинова градиентна плоча, показваща бактериални колонии, изолирани от стомашно-чревния тракт на H. hampei и тяхната идентичност, определена чрез филогенетични анализи. Основната група получени изолати е P. fulva . б ) Филогенетично дърво за алфа-субединични последователности на кофеинова алфа-деметилаза (NdmA), получени от изолирани бактерии (жълто), а също и от РНК, извлечена от полеви проби от H. hampei (зелено). ° С ) Четириседмични проби от H. hampei, третирани преди това с антибиотици, бяха инокулирани с P. fulva, за да се възстанови способността им да разграждат кофеина, както се демонстрира чрез измервания на кофеина FTIR и GC-MS във фракцията им (вж. Таблица 1).

Изображение в пълен размер

Кислородни профили в червата на H. hampei

Кислородните градиенти се измерват в червата на H. hampei с помощта на микроелектроди. Всички измервания са направени в предната половина на бръмбара (вж. Допълнителна фигура 1). По време на тези процедури върхът на електрода се извежда на повърхността на чревната стена и се задържа в положение, докато измерените концентрации на O2 се стабилизират. Във всички случаи, когато върхът проникне в чревната стена, концентрациите на кислород намаляват със стръмни градиенти, преминаващи от микроаерофилни условия към намаленото анаеробно ядро ​​(Фигура 4).

Фигурата показва кислородните профили на трите черва на бръмбари. Обърнете внимание на прехода от микроаерофилната област към анаеробното ядро ​​в лумена на предната средна черва (вж. Допълнителна фигура 1).

Изображение в пълен размер

Възстановяване на разграждането на кофеина в H. hampei

Лекуваните с антибиотици лабораторни проби на H. hampei първо са хранени с минимална диета, съдържаща P. fulva за 1 седмица. След това насекомите се прехвърлят на прясно приготвена стерилна минимална диета и се оставят да се хранят в продължение на 4 часа, преди да се събере фракцията и да се определят количествено концентрациите на кофеин. Анализите на GC-MS и FTIR показват почти пълно изчерпване на съдържанието на кофеин във повторно заразената фракция на насекомите (фиг. 3в, таблица 1). Репродуктивната способност на насекомите, лекувани с антибиотици и P. fulva, също беше тествана. Насекомите не са възстановили способността си да се размножават след ваксинация с P. fulva (Допълнителна фигура 3).

дискусия

Въпреки че понякога други насекоми са били хранени с кафеено семе 24, H. hampei е единственото насекомо, което се специализира в храненето и завършването на целия жизнен цикъл изключително в кафените зърна в плодовете 16, 25. По време на оцеляването в тази среда, H. hampei е изложен на хронично излагане на кофеин, известен като токсичния алкалоид 3, 5, 7, 9, 10, което прави това насекомо привлекателна моделна система, в която да се оцени ролята на микробите в адаптацията на животните към необичайна среда. В това проучване тествахме дали разграждането на кофеина в H. hampei се медиира от чревния микробиот на насекомите.

Членовете на чревната микробиота H. hampei са идентифицирани от насекоми, събрани от седем страни производители на кафе и лабораторни колонии. Изчислените анализи на разпределението на β-разнообразието и вариацията показват, че съставът на микробиома на H. hampei е значително свързан с географския произход на кафето, а също и с видовете кафе, където варира (вж. Допълнителни данни 1). Образуването на морфокриптични единици по-рано е демонстрирано в проби от H. hampei, взети от различни страни производители на кафе, чрез анализ на микросателитни маркери и генни последователности на COI 30. Тези съобщени „видови комплекси“, заедно с нашите открития за географските вариации на микробни съобщества в H. hampei, могат да показват коеволюцията на насекомите и техните микробиоти. Съдържанието на кофеин варира значително между оценяваните видове кафе 31 и въпреки че не е тествано тук, концентрацията на кофеин може да е друг важен фактор, влияещ върху състава на чревните микробиоми на H. hampei.

За да се потвърди ролята на P. fulva в разграждането на кофеина in vivo, третираните с антибиотици лабораторни проби се реинфектират с P. fulva. След това насекомите се хранят с минимална стерилна диета и техните фракции се събират за количествено определяне на кофеина. Това демонстрира, че повторното инокулиране на P. fulva възстановява способността на H. hampei да разгражда кофеина (фиг. 3в, таблица 1), потвърждавайки значението на този член на чревната микробиота в процеса на детоксикация на кофеина. За да се провери дали P. fulva сам по себе си може да помогне на H. hampei да регенерира репродуктивната си годност, трета група лекувани с антибиотици насекоми се инокулират с P. fulva и се използват за оценка на годността. Въпреки това, насекомото не възвърна способността си да се размножава след инокулация. Процесът, толкова сложен, колкото размножаването, може да изисква правилен хранителен статус на насекомите, който разчита отчасти на метаболитната активност на свързаните микроби, или може да изисква наличието на други бактериални ендосимбиони, за които е известно, че влияят на репродуктивното здраве 34. Определянето на минималния набор от микроорганизми за възстановяване на репродуктивната годност, както и сравняване на ефекта на видовете кафе с различни концентрации на кофеин върху микробни съобщества, свързани с H. hampei, са важни теми за по-нататъшни изследвания.

Тук ние демонстрираме, че H. hampei, най-разрушителният вредител на кафе в страните производителки на кафе, споделя общо ядро ​​на чревната микробиота, което се споделя между индивиди от различни географски райони, и че много от тези организми могат да съществуват на кофеина като единствен източник. въглерод и азот. Ние също така демонстрираме, че микробиотата на H. hampei е отговорна за разграждането на кофеина в храносмилателния тракт на насекомите. Микробните общности играят важна роля във всички екосистеми, от участието в цикличния кръговрат на хранителни вещества до формирането на имунната система на човека 35, 36, 37. Нашата демонстрация на ролята на чревната микробиота за детоксикацията на кофеина при H. hampei има важни последици за разбирането на метаболизма и екологията на този важен вредител на кафе. Той също така предоставя нови възможности за разработване на стратегии за биоконтрол, където микробиомът представлява нова цел, тъй като ролята на асоциираните микроорганизми в подобрената способност на гостоприемника да оцелее и да доминира във враждебна среда.

методи

Проби от насекоми

Проби от H. hampei (n = 68; допълнителни данни 1) са получени от Кения (Kiambu), Индонезия (Източна Ява), Индия (Карнатака), Пуерто Рико (Adjuntas), Хаваи (Kona), Гватемала (Coatepeque) и Мексико ( Chiapas Допълнителна информация 1). Насекомите от Индия са събрани от хибрид C. arabica и robusta (C. congensis × C. canephora). H. obscurus, H. crudiae и S. maurus са получени от щамове листа Cecropia в Чиапас, Мексико. За целите на биогеографското проучване и сравнение бяха включени и изкуствени отглеждани кафени плодове 38 (лабораторни насекоми). Във всички пунктове за събиране отделни насекоми бяха поставени живи в епруветки, съдържащи RNAlater (Ambion, Grand Island, NY, USA) и изпратени в лаборатория за анализ.

ДНК екстракция, PCR амплификация и високоефективно секвениране

Анализ на 16S рРНК гени

Изолиране на разграждащи кофеина бактерии и тяхното идентифициране

Скрининг на гена ndmA в изолати и H. hampei

O 2 измервания с помощта на микроелектроди

Време за диетичен транзит в H. hampei

Антибиотично лечение и реинфекция

Откриване на кофеин в проби от фрас

Използвани са две стратегии за определяне на концентрацията на кофеин в проби от лекувани с антибиотици, заразени с антибиотици бръмбари и контролни бръмбари: измерване на кофеина в суров чипс чрез FTIR и измерване на извлечения кофеин от дървесен чипс чрез GC-MS,

За FTIR и GC-MS анализи, значителни разлики между леченията (контролни, лекувани с антибиотици и антибиотици/лекувани/повторно инокулирани) бяха определени чрез еднопосочен дисперсионен анализ и най-малките значими разлики, използвайки софтуерната среда R 53. .

Ефект на антибиотиците върху репродукцията на H. Hampei

Сто жени наскоро се появиха, когато възрастните бяха поставени с 20 мъже във флакони, съдържащи редовна диета, и инкубирани в продължение на 14 дни, за да се максимизира чифтосването. След първоначалната инкубация на сдвояване отделните жени бяха прехвърлени във флакон, съдържащ или редовна диета (контрол), или диета, допълнена с антибиотици (както е описано по-горе) и инкубирани в продължение на 44 дни. Трета група от съчетани жени са били лекувани с антибиотици в продължение на 3 седмици, диетирани с P. fulva и също инкубирани в продължение на 44 дни. Петнадесет флакона от всяко третиране бяха разрушително събрани през всяко време за вземане на проби (дни 14, 24, 34 и 44) и бяха скринирани за яйца, ларви, какавиди и възрастни. Извършена е логическа регресия върху сумата от всички фази във всеки флакон. Тогава моделът беше подходящ само с основните ефекти (DIET - контрол, антибиотици, инфекция и ПРОБА - време за вземане на проби), където беше включена прекомерна дисперсия. И двата основни ефекта са значителни, т.е. има значителен ефект на DIET в сравнение с контролата и има значителен ефект на пробата (по-късните проби имат по-голям брой).