елементи
абстрактно
Географско картографиране на видовете Decalepis в Индия. Картите са генерирани с помощта на инструменти в Google Earth версия 7.1.7.2606 (http://www.neowin.net/news/google-earth-pro-7172606) въз основа на записани GPS координати (Garmin) в пунктовете за събиране.
Изображение в пълен размер
В нашето неотдавнашно проучване за оценка на генетичното разнообразие и структурата на популацията в дивите популации на D. arayalpathra въз основа на демографски проучвания и генетични данни от маркерни тестове, ние демонстрирахме появата на ниско генетично разнообразие и висока генетична диференциация между популациите 16. Освен това е установено, че популациите имат ограничено разпространение и висока фрагментация и е установено, че са прекомерно експлоатирани от разрушително събиране. Широката специфичност, увреждане на плодовите оси, тесен статус на популацията, ограничен поток от гени и гъбично кореново гниене са фактори, които застрашават тази група в естественото им местообитание 16, 17. Това сигнализира за необходимостта от разпознаване на таксони в горещите точки за биологичното разнообразие, което е ключов фактор за прилагане на разпоредбите за растителна защита и бъдещата защита на видовете 18 .
Досега много изследователи са оценили комбинацията от няколко предложени пластидни и ядрени области, за да проведат цялостните си изследвания в таксономично сложни групи от 24, 25, 27, 29, 34, 35, 36. Понастоящем изследванията на баркодовете излизат извън тази фаза на оценка. В допълнение към практическото приложение, което предоставя познания за таксономията на видово ниво, тази технология е призната за ефективен инструмент, като предоставя предизвикателна дискриминационна сила за търговските видове (изброени в CITES), съдебна идентификация и екологичен съдебен анализ, както и идентификация на видовете за редки видове. застрашени и застрашени групи растения 37, 38, 39. Потенциалът на ДНК баркодовете да идентифицират даден вид дори от малко количество тъкан (вместо от цялото растение, за предпочитане на етапа на цъфтеж, както се изисква от настоящите таксономични методи) разширява набора от таксономични инструменти, като се справя с незаконната търговия със застрашени видове.
При липса на единен консенсус на универсалния растителен код за растенията е необходимо да се определят оптималните региони според съответните таксони. Намирането на правилния баркод за рода Decalepis напълно липсва. Следователно, това проучване е предназначено да създаде първата по рода си справочна библиотека, която използва най-ефективните баркодове, за да осигури молекулярна идентичност на застрашени и ендемични видове Decalepis. Ще бъде оценена ефективността на различните аналитични подходи към данните за ДНК баркодиране, за да се тества разделителната способност на избраните маркери за Decalepis. Констатациите от това проучване, потвърдени от динамиката на популацията, предложена в наскоро публикуваното ни изследване 16, ще предоставят ценните инструменти, необходими за установяване на стандартен протокол за каталогизиране на идентичността на видовете в прилагането на CITES и за разработване на планове за опазване на управлението на застрашени видове. тази група.
резултатът
Успех на PCR амплификация и секвениране
Маса в пълен размер
Маса в пълен размер
Дистанционен анализ и зони с баркод за идентификация на видовете
Графика на баркод за пет отделни баркода. Разстоянията до най-близкия съсед (NN) спрямо максималните вътрешно-специфични разстояния (%), реализирани от Kimura-2 (K2P), са начертани за дискриминация по видове. Всяка точка представлява един или повече индивиди, тъй като те имат еднакви стойности на вътрешно-специфични и между-специфични разстояния. Точките над реда 1: 1 показват наличието на баркод.
Изображение в пълен размер
Оценка на пропуските в баркодовете за благоприятни комбинации от баркодове на видове Decalepis. Разстоянията до най-близкия съсед (NN) бяха нанесени спрямо максималните вътрешно-специфични разстояния на параметъра Kimura-2 (K2P) (%). Всяка точка представлява един или повече индивиди, тъй като те имат еднакви стойности на вътрешно-специфични и между-специфични разстояния. Точките над реда 1: 1 показват наличието на баркод.
Изображение в пълен размер
Филогенетичен анализ на видове Decalepis, базиран на метода парсимон
За да оценим еволюционните разлики между видовете Decalepis, използвахме методи за разстояние (NJ) и характер (MP) във всички области на баркодовете. Резултатите от подхода, базиран на критерии, надминаха метода NJ, базиран на разстоянието при разпределението на отделни дървесни знаци. Тъй като характеристиките се намаляват в методите на NJ до разстояния, които понякога се губят при двойни сравнения и водят до изкривени разстояния, бяха извършени допълнителни анализи, използвайки MP модела в PAUP.
Строго консенсусно дърво, показващо връзката на видовете Decalepis, получено в резултат на анализа на максималната съобразеност, използвайки баркода rbcL + matK + ITS. Дължина на дървото = 146, CI = 85%, Ri = 91, RC = 78%. Стойностите за поддръжка на системата за зареждане под 60% не се показват. Лица, съответстващи на монофилни видове: червено: D. arayalpathra, зелено: D. salicifolia, синьо: D. hamiltonii .
Изображение в пълен размер
Сравнение на дискриминантни методи и области с баркодове
Маса в пълен размер
Въз основа на сравнение на методите, подходите TaxonDNA и BLOG се представят еднакво добре средно във всички благоприятни баркодове (и двата осигуряват 75-100% правилна идентификация). Процентът на погрешна идентификация на всички локуси обаче е 0% в TaxonDNA, но 25% в BLOG (Таблица 3, подчертана в сиво). За разлика от това, BLOG превъзхожда TaxonDNA от получените 0% лица като „неидентифицирани“, докато
11, 76% от лицата не са идентифицирани в TaxonDNA. Филогенетичният анализ на видовете Decalepis, базиран на подход, основан на характера, също е довел до определяне на отделни черти на дърветата. По този начин методите, основани на характера, а не разстоянията са подходящ избор за тестване на хипотези.
дискусия
Ефективността на регионите с баркод при изясняване на молекулярната идентичност на видовете Decalepis
Това изследване е първият публикуван опит да се опише молекулярната филогения на застрашените и застрашени видове Decalepis. Това показва, че маркерите с баркод могат точно да различават видовете, разкривайки хомогенни покрития с висока резолюция на видово ниво (фиг. 4). От тестваните пластидни и ядрени локуси, ITS има най-висока ефикасност като единствен локус при идентифициране на видове в Decalepis (фиг. S3). Големият брой на гените на рРНК, по-голямата дискриминантна сила при ниски таксономични нива и по-високата еволюционна скорост правят ITS обещаващ локус в растителната молекулярна система 40. Подобрената филогенетична сигнализация на ITS в сравнение с пластидните маркери за баркод в Decalepis е съвместима с резултатите от други изследвания на ниво род в Passiflora 41, Euphorbia 42, Paeonia 43 и Melilotus 44, наред с други.
Както баркодовете rbcL, така и psbA-trnH имаха най-ниската дискриминантна сила като единствен локус, който ограничава тяхната полезност в Decalepis, въпреки стойността им за баркодове на други растителни групи 20, 24. И двете области не могат да направят разлика между видовете и полученото филогенетично дърво показва огромно свръхсмесване на индивиди с лоша подкрепа на кладата. Установено е, че потенциалният заместител, H. indicus, групиран с D. hamiltonii и D. salicifolia, е неразрешен въз основа на дървото (фиг. S3). Проблеми с неяснотата и честите инверсии, свързани с палиндромни последователности в областта на psbA-trnH, са открити в няколко реда покритосеменни растения и вероятно усложняват използването му като баркод, особено ако се срещат в рамките на видове 29. Пригодността на района на хлоропласта на rbcL за проучвания за еволюционна молекулярна еволюция е противоречива, отчасти поради дължината му
1430 bp. За ясна дискриминация на видовете е необходимо да се секвенира целият регион, което ограничава използването му като баркод последователност. Идеалният регион за баркодиране трябва да бъде достатъчно кратък, за да се усили и да се анализира чрез еднопроходно секвениране 35. Добавянето на други маркери, показващи баркод, подобрява способността им да различават, както е показано в предишни проучвания 29, 31, 35, 45 .
Кодиращата област на хлоропласта matK представлява по-добри кандидат-кодове от кандидат-баркода, показвайки както високо възстановяване на последователността, така и висока степен на идентификация или като единичен локус, или в комбинация с ITS. Комбинацията matK + ITS оформя целия сестрински вид Decalepis като основен клъстер, като H. indicus се намира като външна група във възловия клон в основата на дървото (фиг. 4). Генът на майката хлоропласт показва по-висока скорост на нуклеотидни замествания в сравнение с други локуси, тествани от пластидния геном, което осигурява по-високи междуспецифични стойности на дивергенция между matK последователностите. Ядрената комбинация от двата баркода на локуса ITS + ITS2 също показа много сходен резултат, потвърждавайки предимството на мултилокалния консенсусен баркод подход при растителното кодиране на ДНК на растенията.
Възможност за аналитични методи за осигуряване на ясна дискриминация срещу видовете Decalepis
$ config [ads_text16] не е намерен
Сред трите различни модула ("BM", "BCM" и "Всички видове баркодове"), внедрени в TaxonDNA, комбинираният баркод rbcL + matK + ITS правилно идентифицира 15 вида
Прилагане на инструменти за баркод в защита Decalepis
заключение
Това проучване ясно демонстрира ефективността на ДНК кодирането за идентифициране на ендемични видове. Последователностите на подписа на предложения баркод rbcL + matK + ITS предоставят точни сигнали за улесняване на молекулярната идентичност на видовете Decalepis в съответствие с последната му таксономична ревизия. Регионът ясно оформя целия набор от сестрински видове Decalepis като основен клъстер, с потенциалното заместване на H. indicus във външната група, разположена като възлов клон в основата на дървото. Характерният подход чрез PAUP и BLOG успешно разграничи 100% от изследваните проби, превръщайки тяхната точност и надеждност в метод на избор при изследванията на ДНК баркодиране. Специфичните за вида анализи, получени от последователностите на кодиращия регион на кодиращия регион matK, допълнително потвърждават неговата стойност при осигуряването на точен метод за видова дискриминация. Очаква се включването на различни специфични популации да придобие представа за природозащитния статус на видовете гореща точка Decalepis, както и да подчертае практическото приложение на ДНК баркодирането като инструмент за запазване на биологичното разнообразие на ендемични и застрашени растителни групи.
Материали и методи
Вземане на проби от таксони и етична декларация
От различни географски райони на Тамил Наду, Керала и Карнатака са събрани 15 индивида, принадлежащи към три различни вида Decalepis. Две индивиди от H. indicus са събрани от Тамил Наду и Карнатака (фиг. 1). Пробите се изсушават върху силикагел и се съхраняват при -20 ° C преди екстракция на ДНК. Проби от ваучери за всеки вид, взети в това проучване, се съхраняват в хербарий във Фондацията за съживяване на местните здравни традиции (FRLHT), Бангалор, Индия и CSIR-Централен институт по лечебни и ароматни растения (CIMAP), Лакнау, Индия. справка и съответните подробности са дадени в таблица 2.
Молекулярни методи
Общата геномна ДНК беше изолирана от референтни проби, използвайки протокол цетилтриметиламониев бромид (CTAB) 57. Изолираната ДНК беше тествана за качество и количество чрез 0,8% агарозен гел електрофореза и спектрофотометричен анализ (NanoDrop, ND-1000, САЩ). ДНК се разрежда до крайна концентрация
25 - 50 ng/ul за PCR амплификация. Пет кандидат-локуса на ДНК баркод бяха амплифицирани с установени праймери, които включваха двата кодиращи cpDNA локуса, rbcL и matK; един некодиращ cpDNA интергенен локус спейсър, psbA-trnH и DNA, ITS и ITS2 локуси. Подробности за праймерите и условията на PCR са дадени в таблица SI. PCR амплификации за всеки набор от праймери бяха извършени в 50 μl обем, съдържащ 1X Taq ДНК полимеразен буфер, 200 μM всеки dNTP (dATP: dTTP: dCTP: dGTP на порции 1: 1: 1: 1), 5-10 pmol всеки. праймер (напред и назад), 1 единица ДНК полимераза Taq a
25-50 ng матрична ДНК. Успешните ампликони бяха анализирани чрез електрофореза върху 2% агарозен гел. Впоследствие продукти с целево молекулно тегло се пречистват с комплект за пречистване на PCR на Nucleospin, като се използва протокола на производителя (MACHEREY-NAGEL - 07/2014, Rev.03) и се проверяват повторно чрез електрофореза върху 2% агарозен гел. Полученият продукт беше подложен на реакциите на диокси секвениране на Sanger, в посока напред и назад, използвайки комплекта за секвениране на цикъл BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) на генетичен анализатор ABI 3130 XL (Applied Biosystems).
Базиране на данни
Данни от проби за всеки регион бяха депозирани в баркода на системите за данни за живота (BOLD) 58 (//www.boldsystems.org) по проекта CRCB - „ДНК баркодиране в Decalepis“ (Таблица 2). Всички данни са достъпни на BOLD под набора от данни DS-CRCB (dx.doi.org/10.5883/DS-CRCB). Последователностите бяха предоставени на GenBank и са публично достъпни под номерата за присъединяване, изброени в таблица 2.
Анализ на данни
Електроферограмите, получени за всяка област, обикновено се извикват с помощта на PHRED; последователности, сглобени и модифицирани с помощта на Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI, USA). И накрая, последователностите бяха взривени до NCBI BLAST в рамките на програмата BLASTN 2.2.1+ 59, 60 и по-нататък до BOLD, използвайки заявка за идентификация, за да се провери тяхната хомология с други налични последователности. Всички последователности на баркодове бяха с дължина над 500 bp и без замърсяване. След това модифицираните последователности бяха подравнени с мускул 3.8.31 на уебсайта EMBLEBI (//www.ebi.ac.uk) под параметрите по подразбиране и ръчно модифицирани в BioEdit v7.1.3.0 61. Последователностите бяха отсечени в двата края, за да се отстранят праймерните последователности. Всички променливи на сайта бяха проверени отново с помощта на оригиналните файлове за проследяване. Помирение може да бъде получено от съответния автор при мотивирано искане. Пет кандидат-локуса на ДНК баркод и техните 26 възможни комбинации, заедно с многогенен стъпков баркод подход бяха оценени въз основа на методите, описани по-горе.
Анализ на пропуските въз основа на баркодове
Достъп до знаци чрез BLOG
Баркодирането с LOGic (BLOG) е подход за машинно обучение на знаци с BLOG2.0 за класифициране на пробни последователности във видове, използвайки набор от правила за класификация за местоположението на ключови баркодове на ДНК за диагностични нуклеотиди 66, 67 Той формулира правила за класификация въз основа на предоставения набор от данни за обучение и след това прилага същото към учебния комплект и тестовия набор, за да оцени успеха на идентификацията. Различните набори от данни с баркод, използвани в това проучване, са подложени на 90% нарязване на видово ниво с максимум 500 повторения (GRASPITER = 500) и максимално време от 5 минути за анализ (GRASPSECS = 300). Логическата формула с най-ниска честота на фалшиви положителни резултати в сравнение с референтния набор от данни беше взета за основа за идентификация.
Филогенетични дървета, използващи методи, базирани на разстоянието и характера
За да се дефинират видовете в отделни кладове или монофилетични групи, беше извършен филогенетичен анализ на изследваните масиви от данни. Процесът на разработване на данни за последователността беше оценен въз основа на методи, базирани на разстояние и характер. За изчисляване на еволюционното разстояние между последователностите се използва съседно свързване към алгоритъма за клъстериране с минимална еволюция (NJ). NJ дърветата са конструирани в PAUP 4.0 68 въз основа на разстояния от K2P като генетично измерване и задаване на отрицателни дължини на клонове на нула.
Сред подходите, основаващи се на характера, методът на максималния парсимон (MP) е използван за определяне на най-вероятната история на еволюционни събития между последователностите. MP анализът беше извършен в PAUP 4.0 с модела на HKY-гама заместване, за да се отчете промяната в скоростта между обектите. Извършено е първоначално евристично търсене с 1000 реплики и обменът на клонове е извършен с помощта на бисекционно-повторно свързване (TBR). Във всяка стъпка бяха проведени максимум 10 дървета с произволни последователни добавяния за стартовото дърво във всяко повторение. Дърветата в първия кръг бяха подложени на второ търсене чрез размяна на TBR с капацитет до 15 000 дървета и размяна за завършване. Надеждността на възела беше оценена чрез тест за зареждане с 1000 псевдо-репликации 69, 70, 71. H. indicus е използван като изходна група за всички методи.
Наличност на данни
GenBank (NCBI) [//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank] Номерата за присъединяване за нуклеотидни последователности са дадени в Таблица 2. Подравняването на последователността беше архивирано в проекта BOLD [//www.boldsystems.org] DS-CRCB (dx.doi.org/10.5883/DS-CRCB).
Благодаря
Авторите са благодарни на директора CSIR-CIMAP, Лакнау, за неговото насърчение и осигуряване на лабораторни условия за проучване. Финансова подкрепа от Съвета за научни и индустриални изследвания (CSIR), Ню Делхи, Индия до XII. Проектите FYP Biopros-PR (BSC-0106) и ChemBio (BSC-0203) са признателни.
Електронен допълнителен материал
Базово базирано кодиране за IUCN удостоверяване и опазване Застрашени видове от рода Decalepis (Apocynaceae) \ t
Коментари
Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако смятате, че това е обидно действие, което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, сигнализирайте за неподходящо.