абстрактно

Основното

Повечето публикувани проучвания анализират само един или два гена или генни продукти при чернодробна стеатоза или NASH и следователно не демонстрират потенциалното молекулярно разнообразие на тази често наблюдавана хистологична характеристика на черния дроб. Последният напредък в технологията на микрочиповете и биоинформатиката показа молекулярна хетерогенност въз основа на профили на генна експресия в целия геном. Наскоро публикувани данни от микрочипове показват значителни разлики в експресията на гени, важни за поддържането на митохондриалната функция между пациенти с NASH и здрави индивиди. 13 Тук сравнихме нивата на иРНК в геноми в нормален черен дроб и в мастен черен дроб без хистологични признаци на възпаление, за да подобрим разбирането си за физиопатогенезата на стеатозата per se. .

Материали и методи

Пациент и тъканни проби

Маса в пълен размер

Хистологичен анализ на човешки чернодробни биопсии е извършен от двама независими патолози. Степента на стеатоза се определя като 1, когато по-малко от 30% от хепатоцитите имат липидни вакуоли и 2, когато 30-60% от хепатоцитите представят липидни вакуоли. Разгледани са две групи чернодробни биопсии: първата група се състои от девет чернодробни биопсии без хистологични данни за стеатоза или възпаление; втората група се състои от девет чернодробни биопсии със стеатоза 1 (n = 5) и степен 2 (n = 4). Нито един от използваните черен дроб не показва фиброза, корпускули или цироза. Средният ИТМ е 26,5 ± 4,3 кг/м2 в групата на стеатоза и 22,7 ± 3,0 кг/м2 при пациенти без стеатоза (Р 16, 17, 18). Тази процедура отчита общото разпределение на статистическите данни от тестовете и използва преизбиране ( напр. Bootstrap или пермутация), за да се оцени това разпределение.

Анализът на данните е извършен с помощта на софтуер с отворен код R, версия 1.9.0. (CRAN, www.cran.r-project.org). Функцията hclust от пакета със статистически данни беше използвана за йерархично клъстериране. Използвани са следните пакети за проекти на Bioconductor (www.bioconductor.org 19): affy 20 за предварителна обработка на данни, multtest 21 за идентифициране на диференцирано експресирани последователности и анафия за генна анотация.

Количествена RT-PCR

Маса в пълен размер

Количествено определяне на MtDNA

Количествено определихме митохондриалната ДНК (mtDNA) в общата ДНК, извлечена от всяка чернодробна биопсия с (n = 20) и без (n = 20) стеатоза, използвайки метода, описан по-горе. Накратко, ядреният ген (TaqMan® β-актинов реагент, Perkin Elmer, Courtaboeuf, Франция) и митохондриалният ген MT-CYB (цитохром b или cyt b) са количествено определени количествено чрез количествена PCR в реално време. Амплифицирахме част от митохондриалната генна цитозия със специфични праймери (Таблица 2). PCR смесите съдържаха 7 μl вода, 12,5 μl qPCR реагенти Mastermix Plus® (Eurogentec, Angers, Франция), 0,4 pmol/μl от всеки праймер и 0,2 pmol/μl от всяка сонда. Всяка проба беше подложена на PCR в реално време в три екземпляра. Условията на усилване са същите, както е описано по-горе. Флуоресценцията се измерва в края на всеки етап на отгряване. Във всеки цикъл беше включена стандартна крива от 10, 100, 1000, 10 000 и 100 000 еквивалента на ядрения геном и същите еквивалентни стойности на ядрения геном бяха използвани за количествено определяне на гените β-актин и cyt b. Данните бяха изразени като отношение на средната стойност на митохондриалната ДНК (cyt b) от трикратни измервания към средната стойност на ядрената ДНК (β-актин) от трикратни измервания за даден екстракт (mtDNA/β-актин).

имунохистохимия

Общо 34 фиксирани с формалин чернодробни тъкани бяха получени от нашия набор от хирургични патологии, които бяха идентифицирани с помощта на компютърна база данни за извършване на имунохистохимични анализи. Има 11 проби от черен дроб със стеатоза, 11 проби от черен дроб без стеатоза, четири заразени с HCV черен дроб, показващи стеатоза и осем проби от стеатохепатит поради прекомерна консумация на алкохол (n = 4) или затлъстяване (n = 4). Конструкцията на тъканните микрочипове е получена, както е описано в Kononen et al. Всеки случай съдържа триплет чернодробна тъкан като петна с диаметър 0,6 mm. Имунооцветяването се извършва, като се използва стандартна техника на авидин-биотин пероксидаза със събиране на антиген в съответствие с изследваното антитяло. Използваните първични антитела са моноклонални антитела срещу митохондриален антиген (разреждане 1:50, клон 113-1; Biogenex, Сан Рамон, Калифорния, САЩ), анти-TGFB1 поликлонални антитела (sc-82) (разреждане 1: 100, Санта Круз, CA)., CA, USA), анти-IL1-R1 (1: 400 разреждане; AB-269-NA, R&D система, Лил, Франция) и anti-IGF2 (1: 800 разреждане; AF-292-NA, R&D System, Лил, Франция). Диаминобензидин се използва като хромоген и хематоксилин като ядрено контрастно вещество. За отрицателни контроли първичното антитяло е било пропуснато или заменено с подходяща концентрация на нормален IgG от същия вид. Анализът също е описателен и полуколичествен, като се взема предвид клетъчното местоположение на сигнала в допълнение към процента на положителните клетки с резултат 0 (без оцветяване), 1 (по-малко от 25% от клетките), 2 (между 25 и 75% от клетките). ) и 3 (повече от 75%). Интензитетът на имунооцветяването също е оценен като 1 (слаб), 2 (среден) и 3 (силен). Анализът на трите ядра на проба беше подобен и показа еднаква степен на оцветяване между всички ядра за всички антитела с изключение на моноклоналното антитяло срещу митохондриален антиген; беше определен среден резултат. Всички секции бяха оценени независимо от двама патолози.

Статистически анализ

Средното и стандартното отклонение бяха изчислени в обезмаслената чернодробна група и мастната чернодробна група и резултатите бяха сравнени с t-теста на Student (a = 0,05). Резултатите от имунохимията бяха сравнени с χ 2 теста (α = 0,05).

резултатът

Генната експресия

Избрахме чернодробни биопсии въз основа на наличието или отсъствието на чернодробна стеатоза и липсата на микроскопични признаци на възпаление. Нито една от пробите не показва признаци на фиброза, тела или цироза. РНК е получена от 18 биопсии на човешки черен дроб (девет и девет без чернодробна стеатоза); двете групи не се различават, освен че ИТМ е значително по-висок в групата пациенти с чернодробна стеатоза.

РНК на всяка чернодробна биопсия беше хибридизирана с Affymetrix HG-U133A GeneChips, съдържащ приблизително 22 300 човешки транскрипции. Дендрограмата, получена чрез агломериране на йерархично групиране на чернодробни проби без генна селекция, е показана на Фигура 1. Девет стеатотични чернодробни проби са групирани, докато девет нормални чернодробни проби имат по-хетерогенни профили на генна експресия.

изследване

Йерархична агрегация на нормални и стеатотични чернодробни проби. Агломерационното йерархично клъстериране се извършва без предварителна селекция на гена, като се използва евклидово разстояние като мярка за разликата между пробите и средната асоциация като мярка за различие между два клъстера. "N" означава нормална чернодробна проба, а "S" означава стеатозна чернодробна проба.

Изображение в пълен размер

В съответствие със стъпките за намаляване на множеството семейства за контрол на грешките при много семейства (Wise Error Wise Error 5%, т.е. 5% вероятност да има поне една грешка от тип I), 110 последователности са били диференцирано изразени в нормални и стеатотични чернодробни проби . От тях 100 последователности са свръхекспресирани и 10 са недостатъчно експресирани в стеатозни чернодробни проби. Списъци на свръхекспресирани и недоекспресирани последователности са дадени в Таблица 3. Фигура 2 показва профилите на експресия на тези 110 последователности в 18 чернодробни проби.

Маса в пълен размер

Експресионни профили на 110 диференциално експресирани последователности (FWER = 0,05) в девет нормални и девет стеатозни чернодробни проби. Всеки ред представлява последователността на сондата и всяка колона представлява чернодробна проба. Мерките за изразяване са стандартизирани за всяка последователност на сондата (т.е. стандартизирани редове). Зелената до червената палитра се използва за изразяване на нива на изразяване, като зеленото представлява недостатъчно изразяване, а червеното представлява свръхекспресия. Имената на гените са изброени в таблица 2. "N" означава нормална чернодробна проба, а "S" означава стеатозна чернодробна проба.

Изображение в пълен размер

Гените бяха класифицирани в девет семейства според тяхната функция (Таблица 3). Едно от тези семейства включва гени, кодиращи протеини на митохондриалната дихателна верига и ензими, участващи в липидния метаболизъм и синтеза на креатин. Друго семейство включва гени, кодиращи йонни транспортери, липидни транспортери (аполипопротеин С-IV, участващ в производството на липопротеини с много ниска плътност, докато аполипопротеин Е и рецептор за отстраняване на В тип 1 участват в селективното поемане на холестерол). Повечето диференцирано експресирани гени принадлежат към семейство транскрипционни фактори (ядрени и митохондриални транскрипционни фактори) или кодирани протеини, участващи в контрола на клетъчния цикъл (сигнална трансдукция, апоптоза и клетъчен цикъл), модификации на протеини и ремоделиране на извънклетъчната матрица. Две групи гени са замесени в пътища за възстановяване на увреждане на ДНК или възпалителни пътища; това са TOLLIP, единствената свързана с Ig молекула IL-1R (SIGIRR) и TGFB1 .

Съдържание на митохондрии и митохондриална ДНК в нормален и мастен черен дроб

Количествената PCR в реално време се използва за определяне на съотношението на mtDNA към ДНК в 40 чернодробни биопсии, включително 18 биопсии от изследването на генното профилиране и 22 допълнителни проби. Средните съотношения на mtDNA към съдържанието на ДНК са 0.67 ± 0, 10 и 1, 12 ± 0, 14 в групата на чернодробни биопсии без и със стеатоза (P = 0.011, таблица 4). Този резултат се подкрепя от имунооцветяване на митохондрии, използвайки анализ на тъканни микрочипове (Фигура 3). Всъщност се наблюдава увеличение на броя на митохондриите в хепатоцитите на мастните капчици (макровезикуларна стеатоза), като се използва дълбоко оцветяване и се брои броят на кафявите петна (Фигура 3в и г). При нормален черен дроб багрилото се разпространява в чернодробната тъкан (Фигура 3а и б). Полуколичествената оценка на оцветяването показва значителна разлика между двете групи (две положителни проби от 11 нормални черни дроб срещу девет положителни проби от 11 мастни черни дроб; χ 2; P

Примери за имунооцветяване на митохондриите (кафяви) със специфично антимитохондриално антитяло в нормален черен дроб ( а, б ) и в макровезикуларен стетален черен дроб ( ° С, д ) от тъканен микрочип. Сърцевината е оцветена с хематоксилин (син). а ) Имунооцветяването се разпространява в нормалната чернодробна тъкан (× 20), напускайки порталната вена. ( б ) (× 40) представлява увеличението на квадрата от точка ( а ) и показва петното, разпределено в хепатоцитите. ° С ) Имунооцветяването е фокусирано върху стеатозата на чернодробната тъкан (× 20). ( д ) (x 40) представлява увеличението на квадрата от ( ° С ) и показва петно, насочено около сърцевината и вакуолата със силна интензивност на оцветяване.

Изображение в пълен размер

Валидиране на свързаната със стеароза генна експресия в други чернодробни проби

Използвайки процедурата TaqMan®, ние определихме количествено три гена, участващи във възпалителния отговор, които показаха силно значима диференциална експресия в нормален и мастен черен дроб (Таблица 2). Предполага се, че ортолозите на миши междинен сигнал за мишка са били в еволюционно запазения път на пътни такси (SITPEC), мит-взаимодействащ протеин (TOLLIP) и SIGIRR иРНК. Потвърдихме увеличаване на експресията на иРНК на тези гени в мастния черен дроб в сравнение с нормалния черен дроб (1, 71 ± 1, 03 срещу 0, 90 ± 0, 19; 3, 28 ± 2, 24 срещу 1, 41 ± 0, 54; 0, 74 ± 0,30 срещу съответно 0,48 ± 0,24, Таблица 4). Анализирахме връзката между повишената експресия на тези гени и ИТМ. Наблюдавахме само тенденция на корелация между нивата на mRNA на TOLLIP и ИТМ (P = 0.0555). Интерес представлява повишаването на експресията на митохондриален антиген, IL-1R1, IGF2 и TGFB1 при повечето свързани с HCV стеатоза и стеатохепатит. IL1-R1 винаги е бил силно изразен в алкохолно свързан стеатохепатит или затлъстяване и в половината от свързана с HCV стеатоза (Таблица 5). Фигура 4 показва равномерното разпространение на оцветяване с IL1-R1 в чернодробната тъкан. За разлика от това, IGF2 се експресира в нормален черен дроб и се наблюдава само увеличаване на интензивността на имуномаркирането.

Маса в пълен размер

IL1-R1 се експресира в цитоплазмата на хепатоцитите в норма ( а ) също и при мастен черен дроб ( б ). Имунореактивността е по-интензивна при стеатозните образци. ( а, б ) × 20.

Изображение в пълен размер

дискусия

Нашите резултати също така предполагат, че извънклетъчният матрикс може да бъде променен от началните етапи на FLD. Това може да се дължи на повишени концентрации на вътреклетъчни мастни киселини в чернодробния паренхим, за които вече е доказано, че са директно токсични за хепатоцитите, което води до оксидативен стрес, възпаление и фиброгенеза, но не и до митохондриална токсичност. Това може да се дължи и на свръхекспресия на гени като IGF2, IGFB4 и IGFBP киселинна лабилна единица или Claudin 3 или хепсин, действащи чрез активиране на TGFB1 Kupffer клетки/макрофаги или звездни клетки, водещи до ремоделиране на извънклетъчния матрикс или активиране на клетки като при чернодробна регенерация или активиране на апоптоза в чернодробните клетки за контрол на теглото на хепатоцитите. Експресията на 35, 36, 37, 38 TGFB1 и IGF2 протеин беше увеличена в повечето проби, показващи или стеатоза, или стеатохепатит и потвърждава нашите резултати от профилиране на генната експресия. Базалната експресия на IGF2 в нестеатотичния черен дроб доведе до затруднения при интерпретирането на резултатите.

В заключение, нашите резултати показват, че митохондриите играят важна роля от ранните етапи на стеатоза, вероятно за осигуряване на чернодробен липиден катаболизъм, с повишено митохондриално фосфорилиране и окислителен метаболизъм. Въпреки че не са наблюдавани микроскопични признаци на възпаление при чернодробни биопсии, увеличена експресия на гени или протеини, участващи в възпалителни пътища и/или ремоделиране на извънклетъчната матрица, като TGFB1, IL1-R1 и IGF2, се наблюдава в мастния черен дроб. Изглежда, че IL1-R1 играе роля в развитието както на стеатоза, така и на стеатохепатит и може да се счита за ранен и точен маркер при пациенти с риск от развитие на NASH.