абстрактно
Основното
Понастоящем са въведени редица мощни ароматазни инхибитори за употреба при жени в постменопауза с хормонозависими тумори на гърдата (Miller, 1999). Докато тяхното развитие представлява значителен напредък в терапиите, налични за лечение на жени с рак на гърдата, степента на пълен и частичен отговор, когато се използва като лечение от втора линия, остава относително ниска (10–20%) с времето до прогресията на тумора. относително кратък (3-6 месеца) (Santen and Harvey, 1999). Въпреки това, в скорошно проучване с адювантна употреба на инхибитор на ароматазата срещу тамоксифен, самостоятелно или в комбинация, преживяемостта без заболяване е значително по-дълга при субекти, получаващи терапия с инхибитор на ароматазата (ATAC Trialist Group, 2002). В допълнение, редица нежелани странични ефекти, включително стомашно-чревни проблеми, замайване и гадене, са свързани с употребата на някои инхибитори (Buzdar et al, 1997). Използването на инхибитори на ароматазата при жени в постменопауза с рак на гърдата също има неблагоприятен ефект върху серумния липиден профил (Elisaf et al, 2001). Следователно е необходимо да се разработят нови методи за инхибиране на ароматазната активност, които биха могли да действат конкретно в гърдите, но би трябвало да заместват други чувствителни към естроген тъкани.
Фибробластите, получени от нормални или злокачествени тъкани на гърдата, са използвани като модел за изследване на ароматазната активност, тъй като тези клетки имат много по-високи нива на активност от епителните клетки (Singh et al, 1999). Използвайки такива фибробласти, са идентифицирани редица цитокини, включително интерлевкин 6 (IL-6) и фактор на туморна некроза (TNFα) като важни регулатори на фибробластната ароматазна активност (Reed et al., 1992; Macdiarmid et al., 1994). Периферната ароматазна активност се увеличава при възрастни и затлъстели индивиди (Grodin et al., 1973; Hemsell et al., 1974) и производството на IL-6 също се увеличава при тези условия (Wei et al., 1992; Mohamed-Ali et al., 1997),
Способността на IL-6 да стимулира ароматазната активност в култивирани фибробласти се засилва значително (до 21 пъти) от неговия разтворим рецептор, IL-6sR (Singh et al., 1995; Zhao et al., 1995a, 1995b). IL-6 се произвежда от фибробласти, получени от нормални и злокачествени тъкани на гърдата, докато IL-6sR е открит само в кондиционирана среда, получена от злокачествени фибробласти (Singh et al, 1995). Много тумори на гърдата са инфилтрирани от макрофаги и лимфоцити и има доказателства, че тези клетки могат да бъдат основен източник на фактори, способни да стимулират ароматазната активност в гърдата (Purohit et al, 1995; Reed and Purohit, 1997).
Подобно на други цитокини, IL-6 действа чрез свързване с мембранния рецептор. Комплексът IL-6R се състои от лиганд свързваща субединица с молекулни тегла от 80 kDa (gp80) и 130 kDa (gp130) от протеин за сигнална трансдукция (Taga et al., 1989; Kishimoto et al., 1995). Субединицата gp80, която може да съществува и в разтворима форма (Rose-John and Heinrich, 1994), свързва IL-6 с нисък афинитет и трябва да се свързва с по-голям gp130 за свързване с висок афинитет и трансдукция на сигнала. Докато IL-6 моноклонални антитела (Mabs) са били използвани за отмяна на ефектите на IL-6, те са само частично ефективни (Klein et al, 1991). Mabs образуват комплекс с IL-6, което води до намален клирънс на цитокини.
Като алтернативен начин за блокиране на действието на IL-6, Ciliberto и колеги са разработили редица IL-6 рецепторни антагонисти, които са мутирали форми на IL-6, които могат да се свържат с IL-6R, но да го блокират в неактивна конфигурация ( Demartis et al., 1996). Това инхибира способността му да взаимодейства с gp130 протеина за трансдукция на сигнала. Вариантът IL-6 на Sant 7 е идентифициран като най-мощният суперантагонист и е в състояние да инхибира стимулирания от IL-6 растеж на няколко различни вида злокачествени клетки. Поради важната роля, която IL-6 + IL-6sR играе в регулирането на ароматазната активност, беше изследвана способността на Sant7 да блокира стимулираната от цитокини активност на ароматазата. Sant 7 също е използван за получаване на допълнителна информация за процеса, чрез който PGE2 регулира ароматазната активност в фибробластите, получени от гръдната тъкан.
Материали и методи
Фибробластна култура
Взети са проби от мастна тъкан на гърдата от жени, подложени на редукционна мамопластика. Освен това на жени, подложени на лумпектомия или мастектомия, са взети проби за мастна тъкан в близост до тумори на гърдата (т.е. „неучастваща“ тъкан) и тумори на гърдата. Проби от тъкани са получени с информирано съгласие от субекти, одобрени от болничната комисия по етика.
Резектираните тъкани се смилат със скалпели и се инкубират в модифицирана от Eagles минимална есенциална среда (EMEM) в продължение на 18-24 часа при 37 ° С с колагеназа (200 μg ml-1). Диспергираните клетки се събират чрез центрофугиране и се промиват два пъти със среда за отстраняване на колагеназа. Диспергираните клетки се посяват в 25 cm 2 колби за култивиране и се оставят да се прикрепят. Клетките се отглеждат до сливане в EMEM, съдържащ HEPES буфер (20 mmol-1), 10% фетален телешки серум (FCS) и добавки (Reed et al, 1992). Клетките се рутират рутинно два до три пъти, след това се засяват с 25 cm 2 колби за култивиране и се отглеждат до 70-80% сливане. Средата беше заменена с 2% c. В тази среда се добавя дексаметазон (100 пМ) в присъствието на дексаметазон (100 пМ) за 48 часа и включва: IL-6 + IL-6sR (50 и 100 ng ml-1, изследвания и разработки). Systems Ltd, Abingdon, Oxon, UK) и PGE2 (10 μM, Sigma, Poole, Dorset, UK).
Сант 7
Суперарантагонистът IL-6R Sant 7 е получен от Sigma-Tau (Рим, Италия) и синтезиран, както е описано по-горе (Salvati et al., 1995). Sant 7 се разтваря в хранителната среда преди добавяне към клетките.
Тест за ароматаза
Ароматазната активност се измерва в непокътнати фибробластни монослоеве, използвайки (1β - 3H) андростендион (15-30 Ci mmol - 1, NEN - Du Pont, Stevenage, Herts, UK) в продължение на 3 - 20 часа (Reed et al, 1992). Накратко, фибробластните монослоеве се измиват веднъж с балансиран физиологичен разтвор на Ерл (2.5 mL), освен ако не е посочено друго. 3H андростендион (0.25 μCi) се добавя към всяка колба, за да се получи крайна субстратна концентрация от 3 до 4 nM. Фибробластните монослоеве се инкубират със субстрат в продължение на 3 до 20 часа при 37 ° С в зависимост от активността на базалната ароматаза в клетките. Колбите, които не съдържат клетки, също се инкубират със субстрат и среда без серум като заготовки. След инкубация, аликвотна част от средата (2 ml) се отстранява от всяка колба и аликвотите се екстрахират два пъти с диетилов етер (5 ml), който се изхвърля. Останалата водна фаза се третира с еднакъв обем разтвор, съдържащ активен въглен (5,0%) и декстран (0,5%), центрофугира се и се взема аликвотна част от супернатантата (1 ml), за да се определи нейното радиоактивно съдържание чрез течна сцинтилационна спектрометрия. Към днешна дата е установено, че ароматазната активност, измерена във фибробласти, е линейна по отношение на времето до 24 часа (Macdiarmid et al., 1994).
статистика
Значимостта на разликите в активността на ароматазата в третирани и контролни клетки беше оценена с помощта на t-тест на Student. Представени са представителни примери за резултати за експерименти, които са били повторени 2 до 3 пъти.
резултатът
Способността на Sant7 да инхибира стимулираната от цитокини ароматазна активност първоначално беше изследвана във фибробласти, получени от мастната тъкан на гърдата на субект, подложен на редуцираща мамопластика (Фигура 1). В тези фибробласти само IL-6 (при 50 ng ml-1) повишава ароматазната активност с 27%. Въпреки това, добавянето на IL-6sR в комбинация с IL-6 значително подобрява способността му да стимулира ароматазната активност (7,7 пъти в сравнение с контролите). Sant 7 причини значителни (P 1 (Фигура 3).
Ефект на суперарантагониста на IL-6, Sant7 рецептора върху IL-6, IL-6sR или IL-6 + IL-6sR-стимулирана ароматазна активност във фибробласти, получени от намаляване на мамопластичната мастна тъкан. Фибробластите се култивират в 2% отстранен FCS, EMEM без фенол-червено и се добавят в тази среда в продължение на 48 часа в присъствието на дексаметазон (100 пМ). Ароматазната активност се измерва в непокътнати фибробластни монослоеве, използвайки [3H-ip] андростендион като субстрат. Значимостта на разликите в третираните и контролните клетки беше оценена с помощта на t-тест на Student (a, P
( A ) Ефект на Sant7 върху ароматазната активност, стимулирана от IL-6, IL-6sR или IL-6 + IL-6sR във фибробласти, получени от тъкан близо до тумора на гърдата. Фибробластите се култивират в 2% отстранен FCS, EMEM без фенол-червено и се добавят в тази среда в продължение на 48 часа в присъствието на дексаметазон (100 пМ). Ароматазната активност се измерва в непокътнати монослоеве, като се използва [3Н-1р] андростендион като субстрат. Един набор от клетки (предварителна обработка) беше предварително инкубиран със Sant 7 в продължение на 3 часа преди добавянето на IL-6 + IL-6sR, докато за другия набор (без предварителна обработка) Sant 7 беше добавен едновременно с IL-6 + IL -6. 6sR (a, P
Дозов отговор на способността на Sant7 да инхибира стимулирана с IL-6 + IL-6sR ароматаза във фибробласти, получени от тъкан, близка до тумора на гърдата. Sant 7 инхибира стимулираната ароматазна активност с IC50 от 60 ng ml-1 (т.е. три измервания, при които коефициентите на вариация
Способността на Sant7 да инхибира IL-6 + IL-6 sR стимулиране на ароматазната активност във фибробласти, получени от редуцираща тъкан от мамопластика. Клетките се третират в продължение на 48 часа с IL-6 (50 ng ml-1), IL-6sR (100 ng ml-1) или Sant7 (10 ug ml-1) или в комбинации, както е показано, при липса или присъствие на дексаметазон (Dex, 100 nM). Ароматазната активност в контролните клетки е 1370 ± 15 fmol 20 h-1 106 клетки -1 и 639 ± 35 fmol 20h -106 клетки -1, за фибробласти, култивирани в отсъствие или присъствие на дексаметазон (средно ± sd, n = 3) a, P
( A ) Ефект на Sant 7 върху PGE2-стимулирана ароматаза в проксимални фибробласти. IL-6 (50 ng ml-1) + IL-6sR (100 ng ml-1) стимулира ароматазната активност в по-голяма степен от PGE2 (10 μM). Sant7, който блокира стимулираната от IL-6 + IL-6sR ароматазна активност, значително намалява способността на PEG2 да стимулира ароматазната активност в тези фибробласти. За да се определи дали ефектите на Sant 7 са обратими (Rev), един набор от фибробласти (IL-6 + IL-6sR (Rev)) е предварително инкубиран със Sant 7 в продължение на 12 часа и след това Sant 7 е отстранен чрез измиване на клетките с фосфат . - буфериран физиологичен разтвор. IL-6 + IL-6sR стимулира ароматазната активност в тези клетки след промиване в подобен диапазон от фибробласти, които не са били изложени на Sant 7, което показва, че Sant 7 не действа необратимо. (a, P