абстрактно

Генната терапия ще става все по-важна при лечението на вродени или придобити разстройства като атеросклероза и рак. Въпреки това, основните препятствия трябва да бъдат преодолени, преди да бъдат изпълнени очакванията. Една от най-критичните области на генната терапия е проектирането на подходящ, точен и ефективен генен вектор, който може безопасно да се прилага in vivo. 12455 В това проучване изследвахме дали фокусираният ултразвук може да се използва като физически инструмент за трансфекция на култивирани клетки. in vitro и при тумор на простатата при плъхове в Копенхаген in vivo .

За това проучване ние избрахме насочен синусов ултразвук за локализирана трансфекция, тъй като този метод на приложение показа най-високата степен на трансфекция с по-ниска цитотоксичност in vitro .29 Други предимства на фокусирания синусов ултразвук в сравнение с алтернативните ултразвукови приложения са, че фокусът може да бъде неинвазивно поставен размерът му може да бъде модифициран.3031 По принцип всички целеви места в човешкото тяло, до които може да се достигне чрез перкутанни или ендолуминални клинични ултразвукови диагностични устройства. Ако целевият обем излъчва ултразвуков фокус, той може да бъде обработен с ултразвук с множество експозиции. Не се съобщава, че насоченият синусоидален ултразвук медиира трансфекцията. Конкретен въпрос за тази работа беше да се изследва дали насоченият синусов ултразвук може да увеличи ефективността на репортерната плазмидна ДНК трансфекция при ултразвукова интензивност и налягане, подходящи за неинвазивни in vivo приложения без значителни странични ефекти.

За тази цел първо оптимизирахме акустичните параметри в експерименти с акустични клетъчни култури, за да медиираме трансфекцията на β-галактозидаза и луциферазен репортерен ген в няколко клетъчни линии (NIH 3T3 фибробласти, HeLa, R3327-AT1 простатен аденокарцином и Mewo човешки меланом). След това беше тествана възможността за трансфекция in vivo в една от тестваните клетъчни линии, аденокарцином на простатата R3327-AT1, който беше трансплантиран на плъхове в Копенхаген. Цитохимично оцветяване с β-галактозидаза се извършва след директно инжектиране на плазмида в тумора и интравенозно инжектиране. За по-нататъшно изследване на възможностите за трансфекция in vivo на ултразвук, ELISAs бяха извършени за количествено определяне на нивата на белтъка на бета-галактозидаза в тумори на простатата след интратуморално и интравенозно приложение на репортерния ген.

резултатът

Ин витро трансфекция

Първо бяха изследвани възможностите за ин витро трансфекция на фокусиран ултразвук. Флаконите за реакция на рака на простатата (R3327-AT1) се смесват с репортер плазмид и се излагат на ултразвуково поле във воден резервоар, за да се осигури просто и оптимално ултразвуково свързване (Фигура 1). За определяне на оптималните условия на ултразвукова трансфекция бяха използвани 1 х 106 клетки от рак на простатата (R3327-AT1) и 1 μg репортерна плазмидна ДНК (β-галактозидаза) в 500 μl PBS във всеки 500 ml разтвор. Когато пробите от плазмиди се обработват с ултразвук в средата на фокуса на звуковото поле, β-галактозидазата се изразява силно, което показва успешен трансфер на ДНК. Установихме увеличение на скоростта на трансфекция до 220-кратна стимулация с увеличаване на амплитудата на налягането от 0,1 до 1 MPa, докато процентът на жизнеспособните клетки намалява с по-високи амплитуди на налягане до 5% при 5 MPa (Фигура 2). Най-доброто съотношение по отношение на висока стимулация и висока жизнеспособност на клетките е постигнато при 1 MPa с 80% жизнеспособност. Това налягане се прилага в следващите експерименти, тъй като времето за обработка с ултразвук варира. С увеличаване на времето за ултразвук, скоростта на стимулиране се увеличи до 3 минути, докато жизнеспособността на клетките намаля значително (Фигура 3).

vitro

Схема на устройство за ултразвук. Фокусираният ултразвук се генерира от 10 cm пиезоелектричен дисков преобразувател, фокусиран с полистиролова леща (фокусно разстояние, f = 126 mm) и комбиниран в резервоар за вода от 40 l. Реакционните флакони, съдържащи клетки, смесени с ДНК, бяха поставени във или извън елипсоидалния фокус на звуковото поле при стайна температура. Същото оборудване беше използвано за експерименти in vivo. Плъховете бяха задържани в пластмасова тръба под ъгъл от 45 ° и долната част на тялото им беше потопена във воден резервоар, за да могат туморите в бедрото да се обработват с ултразвук под вода, за да се подобри ултразвуковата връзка. За ултразвук центърът на туморите беше поставен в геометричния фокус на звуковото поле.

Изображение в пълен размер

Влияние на амплитудата на налягането върху стимулацията и жизнеспособността. In vitro трансфекция на β-галактозидазен репортерен плазмид в тунинг клетки на простатата Dunning, подлиния R3327-AT1 чрез фокусиран ултразвук. Ефект на амплитудата на налягането върху стимулацията и жизнеспособността, нормализиран спрямо контрола, определен чрез оцветяване с β-галактозидаза и оцветяване с трипан синьо (n = 4, средно ± se). Експресията на гена се анализира 24 часа след ултразвук. Стимулирането на гънките се изчислява чрез броя на сините клетки, разделен на броя на сините клетки в унесонизираните контроли. Клетъчната жизнеспособност се анализира веднага след ултразвук. Времето за обработка с ултразвук е 3 минути, честотата на импулсите е 100 Hz, дължината на импулса е 4 ms.

Изображение в пълен размер

Влияние на времето за ултразвук върху стимулацията и жизнеспособността. In vitro трансфекция на репортерния плазмид на β-галактозидаза в туморни клетки на простатата Dunning, подлиния R3327-AT1. Ефектът на времето за ултразвук върху стимулацията и жизнеспособността се нормализира до контрола, определен чрез оцветяване с β-галактозидаза и оцветяване с трипан синьо (n = 4, средно ± se). Експресията на гена се анализира 24 часа след ултразвук. Стимулирането на гънките се изчислява чрез броя на сините клетки, разделен на броя на сините клетки в унесонизираните контроли. Клетъчната жизнеспособност се анализира веднага след ултразвук. Амплитудата на налягането беше 1 MPa, честотата на импулса беше 100 Hz, дължината на импулса беше 4 ms.

Изображение в пълен размер

За разлика от това открихме, че нито генният трансфер, нито клетъчната смърт са увеличени в сравнение с контролните клетки в сравнение с контролните клетки, когато флаконите с плазмидна ДНК са поставени извън фокуса на звуковото поле при амплитуди на налягането по-малко от 0,1 MPa. Следващият набор от параметри беше използван в следващите експерименти (амплитуда на налягане 1 MPa, честота на импулса 100 Hz, продължителност на експлозията 4 ms, 3 минути време за обработка с ултразвук).

В допълнение към β-галактозидазната репортерна система, луциферазният ген (CMV-luci) се използва като репортер за потвърждаване на независимо насочена ултразвукова медиирана in vitro трансфекция. След прилагане на луциферазния ген на туморни клетки на простатата при същите условия, както по-горе, и използване на същата процедура за обработка с ултразвук, използвана за β-галактозидазната репортерна система (амплитуда на налягане 1 MPa, честота на пулса 100 Hz, дължина 4 ms). ултразвуково време, 10 μg плазмидна ДНК), луциферазна активност е сравнена между контролите (само ДНК), ултразвукови ДНК разтвори и трансфектирани с калциев фосфат контролни разтвори (ДНК и калциев фосфат, без ултразвук). Активността на луциферазата е 310 пъти по-висока след обработка с ултразвук, отколкото при необработени с ултразвук контроли (Фигура 4). Активността на луциферазата, индуцирана от стандартния метод за трансфекция на калциев фосфат, е само осем пъти по-висока от индуцираната от ултразвук активност на луциферазата.

Активност на луциферазата след целеви ултразвук и CaPo4. Относителна луциферазна активност на клетките R3327-AT1 24 часа след насочена към мястото ултразвукова медиирана трансфекция (US) с CMV луциферазен плазмиден репортерен ген, нормализиран към несонифициран контрол. Флаконите се подлагат на фокусиран ултразвук във воден резервоар за 3 минути при стайна температура (честота на импулса 100 Hz, продължителност на импулса 4 ms, амплитуда на положителното налягане 1 MPa). За сравнение се отчита ефективността на трансфекция с CaPo4 (n = 4, средно ± se). Разликите между индуцирана от ултразвук трансфекция и контрол, както и между трансфекция на CaPo4 и ултразвук, бяха статистически значими (Р

Американска трансфекция на различни клетъчни линии. Фокусирано стимулирано от ултразвук стимулиране на различни клетъчни линии, нормализирано към всяка контрола. NIH 3T3 фибробласти, подклас на тумора на простатата R3327-AT1, човешки меланомни клетки (Mewo) и HeLa клетки бяха смесени с β-галактозидазен репортерен плазмид и обработени с ултразвук при амплитуда на положително налягане от 1 MPa при фокусно поле от 100 Hz. и 4 ms продължителност на пакета за 3 минути (n = 5, средно ± se).

Изображение в пълен размер

Съответните ефективности на трансфекция in vitro са 2% (HeLa), 4% (NIH 3T3), 12% (R3327-AT1) и 3% (Mewo) с жизнеспособност на клетките в диапазона от 50% (Mewo) до 80%. % (R3327-AT1). Следователно, във фокуса на звуковото поле, ефективността на трансфекцията може да бъде показана чрез индуциран ултразвук.

In vivo трансфекция в Dunning R3327-AT1 тумор

Резултатите от хистологичния анализ на експериментите за трансфекция на тумор на Dunning in vivo са показани на фигури 6 и 7. Всички седем тумори на простатата R3327-AT1, които са директно инжектирани с ДНК и са обработени с ултразвук, разкриват β-галактозидазни клетки в положително, синьо оцветяване. За разлика от тях, повечето (пет от седем) тумори с интратуморална инжекция на ДНК без ултразвук не показват сини клетки, а само два тумора с интратуморална инжекция на ДНК, но без ултразвук показват няколко сини клетки. Тази разлика в честотата на откриване на сини клетки между обработени с ултразвук и необработени с ултразвук тумори е статистически значима (P = 0,02, точния тест на Fisher). Сравнявайки броя на положителните клетки в участъци с положителни клетки, открихме, че ултразвукът индуцира 10-кратно увеличение на средния брой на β-галактозидаза положителни клетки след интратуморално инжектиране на плазмидна ДНК в сравнение само с инжектиране на ДНК (P

In vivo трансфекция на тумор на простатата R3327-AT1. Тумор на простатата R3327-AT1. Цитохимично оцветяване на активността на β-галактозидаза след директно интратуморално in vivo инжектиране на репортер на β-галактозидаза плазмид (10 μg ДНК). Туморите бяха резецирани 24 часа след ултразвук, фиксирани в буфериран формалин и вградени в парафин. Тъканните участъци (4-6 μm) бяха оцветени с X-gal буфер и оцветени с неутрално червено (× 160). Подобни резултати бяха получени за всички седем тумора, инжектирани с ДНК и обработени с ултразвук. Тумори без инжектиране на ДНК и тумори с интравенозно инжектиране на ДНК не разкриват никакви синьо оцветени клетки.

Изображение в пълен размер

Ултразвукова индуцирана трансфекция при тумор на простатата R3327-AT1 in vivo. Относителен брой β-галактозидазни положителни туморни клетки при цитохимично оцветяване при контролни животни, само след обработка с ултразвук (US), интратуморална инжекция на ДНК (it), интратуморална инжекция на ДНК плюс ултразвук (it + US), интравенозна инжекция (iv) и интравенозна инжекция плюс ултразвук (iv + US). Нормализираният брой се изчислява чрез нормализиране на необработени с ултразвук тумори, на които се инжектира само ДНК разтворът (т.е. се използват колони за четири до шест тумора). Разликата в броя на положителните клетки след интратуморално инжектиране на ДНК със и без ултразвук е статистически значима (P 0, 3, LSD тест). Също така не можахме да докажем чрез ELISA, че фокусираният ултразвук води до значително ниво на експресия на репортерен протеин в тумори след iv приложение на плазмидна ДНК (P> 0, 2, LSD тест).

Ултразвукова медиирана трансфекция in vivo

За експериментите in vivo са използвани същото оборудване за ултразвук и резервоар за вода, описани по-горе. По време на ултразвук, упоените животни бяха задържани в полиакрилна пластмасова тръба, която беше поставена във резервоара за вода чрез същата система за позициониране, използвана за флаконите. Температурата на водата се поддържа на 36 ° C. Носещият тумор крак се прожектира във водата през отвор в полиакриловия джиг и се фиксира с конец. За обработка с ултразвук центърът на тумора е позициониран в геометричния фокус на звуковото поле (Фигура 1), така че централната ос на разпространението на ултразвук не пречи нито на части от тялото на животното, нито на пластмасовата тръба на входа или изхода мястото на тумора. Контролните тумори се разполагат във водната баня по същия начин, без да се обработват с ултразвук.

Туморите се инжектират с 10 μg CMV-LacZ ДНК в 50 μl PBS 3 минути преди обработка с ултразвук. Инжекцията се извършва в центъра на тумора и иглата се премества бавно по време на инжектирането, за да се осигури широко разпространение и да се избегне вътретуморно кървене или механични промени в тумора. За да избегнем изтичане на ДНК разтвор чрез канулацията поради тумора на тургора, ние бяхме тествали в претестове най-добрия начин за извършване на интратуморалната инжекция. Установихме, че ако иглата остане неподвижна за 2 до 3 минути преди отстраняването на иглата, разтворът остава в тумора. За интравенозно приложение 100 μg CMV-LacZ ДНК в 500 μl PBS се инжектират в опашната вена на животното 3 минути преди обработката с ултразвук.

За цитохимичен анализ туморите бяха резецирани 24 часа след обработка с ултразвук, фиксирани в буфериран формалин и вградени в парафин. Тъканните резени (4–6 μm) бяха оцветени с X-gal буфер и оцветени с неутрално червено. Стимулацията се оценява чрез преброяване на сините клетки на хистологичните филийки с помощта на решетка. Сравнени са съответните представителни зони от 5 mm 2, където могат да бъдат открити най-много сини клетки на отделния резен. Разлики в броя на трансфектираните клетки и мястото и геометрията на областта на генната експресия бяха открити с цитохимично оцветяване.

Три допълнителни тумора бяха само обработени с ултразвук, резецирани 72 часа след лечението и оцветени с хематоксилин-еозин (HE).

Концентрацията на бета-галактозидаза протеин се определя количествено, като се използва ELISA (3 Prime-5 Prime, Boulder, CO, USA) съгласно инструкциите на производителя. Използвайки същия биологичен модел, ултразвукови условия и плазмидни приложения като хистологията, беше извършен друг набор от експерименти. Туморите бяха събрани 24 часа след обработка с ултразвук и замразени в течен азот. За сравнение, при тези животни също са анализирани кожата, покриваща тумора, както и парче бедро мускул в съседство с тумора. Тъканите се смилат на прах и клетъчните лизати се приготвят, използвайки лизисен буфер (10 m M Tris-Cl, рН 8, 1 m M PMFS, 1 μg/ml апротинин). Тъкани отломки се гранулират чрез центрофугиране при 14000 g и общата концентрация на протеин се определя с помощта на Брадфордския анализ (BioRad Laboratories, Ричмънд, Калифорния, САЩ). Стойностите на абсорбцията се определят количествено, като се използва ELISA четец за плаки при дължина на вълната 405 nm. Количеството на β-галактозидаза протеин се определя като ng β-галактозидаза на милиграм протеин. Всички тъканни проби бяха измерени в три екземпляра.

Статистически анализ

Точният тест на Фишър е използван за анализ на пропорциите, а тестът на Student е използван за сравняване на средствата. За множество сравнения се използва дисперсионен анализ (ANOVA) с метода на най-малко значимата разлика на Fisher (LSD). По принцип размерът на пробите in vitro е от четири до пет проби за всяко състояние, а размерът на пробата in vivo е от четири до седем тумора за всяко състояние. Всички анализи бяха извършени със софтуерната програма Statistica 5.0, 43 и всички тестове бяха двустранни.

Благодаря

Искаме да благодарим на Юрген Джене за подкрепата при физически измервания с ултразвук, Петер Пешке за предоставяне на клетките AT1 и подкрепа за хистологичен анализ, Клаус Вебер за предоставяне на клетките Mewo и Юрген Дебус за подкрепа на проучванията. Благодарим на Александра Тиетце за отлична техническа помощ при експерименти с животни. Благодарим на Томас Вирт за обсъждането на проекта и предоставянето на репортерски конструкции и клетките NIH 3T3 и HeLa. Тази работа бе подкрепена отчасти от Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 798/1-1).