производството

  • елементи
  • абстрактно
  • цели:
  • Предмети и методи:
  • резултатите:
  • заключение:
  • Въведение
  • Предмети и методи
  • елементи
  • Клетъчна или мастна култура
  • Екстракция на РНК и количествена PCR в реално време (RTQ-PCR)
  • Определяне на концентрацията на ApN в средата чрез RIA
  • cAMP имуноанализ
  • Уестърн петно
  • Представяне на резултатите и статистически анализ
  • резултатът
  • Ефект на CB1R блокадата върху експресията на гена на адипокин в култивирани експланти
  • Ефект на CB1R блокадата върху адипокините в зрелите адипоцити и SVC
  • Механизми, участващи в регулирането на ApN ES
  • дискусия

елементи

  • Генна регулация
  • Затлъстяване
  • Пептидни хормони

абстрактно

цели:

(1) Да се ​​изследва дали модулацията на канабиноидния рецептор тип 1 (CB1R) директно регулира производството на адипонектин (ApN) и други адипокини в мастната мастна тъкан (OAT) на затлъстели индивиди, (2) за определяне в коя клетъчна фракция на OAT блокадните ефекти се появяват CB1R и (3), за да разкрият основните механизми.

Предмети и методи:

OAT е получен от 30 затлъстели индивида (индекс на телесна маса: 40, 6 ± 1, 3 kg m-2), подложени на коремна операция. Използвани са първични култури от експланти или прясно изолирани адипоцити или стромални съдови клетки (SVC).

резултатите:

В обясненията на OAT, CB1R блокерът Rimonabant увеличава експресията на ApN гена. Повишено е и нивото на иРНК на оментин, което проявява сенсибилизиращи инсулина свойства. За разлика от това, нивата на тРНК на два провъзпалителни цитокини, макрофаги възпалителен протеин (MIP) -1β и интерлевкин (IL) -7, бяха намалени. По-нататък проучихме къде тези ефекти са възникнали в рамките на OAT. Експресията на CB1R е сходна и в двете клетъчни фракции. В изолирани зрели адипоцити, CB1R блокадата блокира увеличаване на ApN иРНК и намаляване на IL-7 иРНК, като същевременно предизвиква увеличаване на секрецията на ApN в средата. В изолирания SVC експресията на гена на оментин, която е ограничена до тази фракция, се увеличава, докато експресията на MIP-1β намалява. Накрая дешифрирахме механизмите, водещи до регулирането на ApN от ендоканабиноидната система (ES). Първо установихме, че ApN регулирането всъщност се медиира от CB1R: Експресията на ApN гена се регулира от Rimonabant и се регулира от CB1R агониста арахидонил-2-хлороетиламид (ACEA). Повишеното регулиране на ApN от Rimonabant не се променя чрез инхибиране на производството на сАМР. Обаче, регулирането на ApN чрез ACEA беше напълно обърнато от p38 митоген-активирания протеин киназен инхибитор (p38MAPK) и ACEA повиши p38MAPK фосфорилирането.

заключение:

CB1R блокадата облекчава възпалителното състояние и в двете клетъчни фракции на OAT, или чрез увеличаване на производството на ApN и оментин, или чрез намаляване на MIP-1β и IL-7 иРНК. Регулирането на ApN на ApN частично включва p38MAPK.

Локалното затлъстяване се характеризира с възпаление на мастната тъкан и нарушена регулация на производството на адипокин с прекомерна секреция на вредни регулаторни пептиди и хипосекреция на защитни пептиди като адипонектин (ApN). 1, 2 Подобна дисрегулация предизвиква развитието на системно провъзпалително състояние с ниска степен, което се счита за изграждане на обща основа за развитието на съпътстващи заболявания на затлъстяването и метаболитен синдром. 1, 3, 4 За този неблагоприятен здравен профил преференциалното натрупване на централна мазнина, а не на подкожна мазнина, изглежда е по-силен рисков фактор. 1

Ендоканабиноидната система (ES), състояща се от канабиноиден тип 1 рецептор (CB1R) и лиганди, получени от ендогенни липиди, модулира енергийната хомеостаза чрез централни орексигенни ефекти и периферни метаболитни ефекти върху няколко органа, включително мастната тъкан, където се увеличава съхранението на енергия. 5, 6 Лицата с наднормено тегло показват по-високи нива на ендоканабиноиди във висцералната мастна тъкан и серума, отколкото слабите контроли 7, 8 и също така показват по-високи нива на ендоканабиноиди във висцералните мазнини, отколкото в подкожната мастна тъкан. 9 Силното активиране на ЕС следователно може да се разглежда като движеща сила, водеща до или свързана с централното затлъстяване. 10

Лечението на пациенти със затлъстяване със селективен CB1R блокер Rimonabant насърчава значително намаляване на телесното тегло и обиколката на талията (индикатор за коремно затлъстяване), както и подобряване на сърдечно-съдовите и метаболитните рискови фактори. 11 Някои от тези подобрения се дължат на повишаване на нивата на ApN в циркулация. Това увеличение е отчасти независимо от загубата на тегло и предполага специфично подобрение на функцията на мастната тъкан. 12

В съответствие с това наблюдение, римонабант повишава експресията на ApN в мастната тъкан на гризачи, третирани in vivo, както и в мишата 3T3-F442A адипоцитна линия in vitro. Периферните ефекти на канабиноидите обаче са слабо проучени в човешката мастна тъкан. Няколко доклада дават противоречиви данни за освобождаването на адипокин от човешките мастни клетки. 14, 15, 16 Тези експерименти са проведени върху адипоцити, диференцирани in vitro от стромални прекурсори, които са изолирани главно от подкожна мазнина на лица без наднормено тегло, 15, 16 след това подложени на фармакологични дози адипогенни коктейли. Въпреки това, по-скоро подкожната мастна тъкан, както и затлъстяването са свързани с метаболитен синдром и абнормен ендоканабиноиден тонус. В допълнение, диференциацията на адипоцитите в контекста на in vivo заедно със запазени клетъчни взаимодействия може да бъде предпоставка за оптимална експресия на ген на адипокин. 17

В допълнение към регулирането на ApN, ние показахме, както и други, че някои адипокини са свръхекспресирани от оменната мастна тъкан (OAT) на затлъстели индивиди и също могат да допринесат за метаболитни и сърдечно-съдови нарушения. 18 Както адипоцитите, така и клетките на стромалните съдове (SVC; т.е. немазни клетки) допринасят за дерегулацията на адипокин при затлъстяването при хора. 18 Въпреки това потенциалната пряка роля на ЕК в СИЦ никога не е разглеждана. Механизмите, залегнали в основата на потенциалното регулиране на адипокините на ЕО, все още се разследват.

Целта на това проучване беше (1) да се оцени дали CB1R модулацията директно регулира производството на ApN и други адипокини в OAT при затлъстели индивиди, (2) да се определи в коя клетъчна фракция на OAT CB1R блокадата възниква и (3) да се разгадае основните механизми.

Предмети и методи

елементи

OAT е получен от 30 затлъстели лица, подложени на бариатрична хирургия (гастропластика с вертикална лента) след еднодневно гладуване (Таблица 1). Пациентите не са лекувани с хормони (напр. Глюкокортикоиди; различни от инсулин за един от тях), нестероидни противовъзпалителни лекарства или други лекарства, за които е известно, че влияят върху мастната маса или метаболизма (например тиазолидиндиони, системни и неспецифични модулатори). адренергични рецептори).

Маса в пълен размер

Кръв се взема от всеки пациент преди операцията. Както е показано в таблица 1, тези пациенти са били със силно затлъстяване, са имали по-високо систолично кръвно налягане, кръвна глюкоза на гладно, нива на липопротеин с ниска плътност и нива на С-реактивен протеин от препоръчаните или нормални, а жените са имали по-ниски нива на липопротеин с висока плътност . Осем пациенти са диагностицирани като диабет тип 2 и са лекувани с диета и/или перорални антидиабетни средства или инсулин за един. Две трети от пациентите отговарят на критериите за метаболитен синдром, определени от общото научно изявление. 19.

За всяка култура са използвани обяснения или клетки от само един субект. Поради ограничената наличност на тъканите, не всички данни могат да бъдат получени от всички пациенти.

Протоколът за изследване е одобрен от местната комисия по етика на Cliniques Universitaires Saint-Luc.

Клетъчна или мастна култура

Използвахме установени протоколи за изследване на производството на адипокини от фрагменти или изолирани клетки от OAT. 18, 20, 21 При тези експериментални условия нито фракционирането на тъканите, нито културата сами по себе си променят нивата на експресия на адипокин. 18.

Екстракция на РНК и количествена PCR в реално време (RTQ-PCR)

Общата РНК от клетки или тъкани беше извлечена с помощта на изолационен реагент TriPure (Roche Diagnostics, Vilvoorde, Белгия). Като цяло, 0,2 до 2 μg от общата РНК са транскрибирани обратно, както е описано. RTQ-PCR праймерите са проектирани с помощта на софтуер Primer Express (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA; виж Таблица 2). Общо 4 до 40 ng еквивалента от общата РНК се амплифицират с помощта на iQSyber Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Nazareth, Белгия), съдържащ 200 nM от всеки специфичен праймер, използвайки iCycler iQ система за PCR детектиране в реално време (Bio-Rad Laboratories) . Накратко, праговите цикли (CT) бяха измерени в два екземпляра. Стойностите на ACT бяха изчислени за всяка проба за всеки ген, който представлява интерес, както следва: CT ген от интерес, -CT репортерен ген с TATA кутия свързващ протеин (TBP) като репортерен ген. Относителните промени в нивото на експресия на един специфичен ген (ACT) бяха изчислени като ACt на тестовата група минус ACT на референтната група и след това представени като 2-AAT (Delaigle et al. 26).

Маса в пълен размер

Определяне на концентрацията на ApN в средата чрез RIA

Концентрациите на ApN се измерват в култивирана адипоцитна среда, като се използва търговски наличен комплект RIA (Linco Research, Nuclilab, Холандия). Този комплект не прави разлика между различните форми на ApN. Пробите от разредена среда (1: 1) бяха анализирани два пъти.

cAMP имуноанализ

Концентрациите на CAMP в клетките бяха измерени с помощта на конкурентна ELISA китка (R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, UK), съгласно инструкциите на производителя. Нивата на CAMP се нормализират до нива на клетъчни протеини, както се определя по метода на Брадфорд.

Уестърн петно

Адипоцитите се хомогенизират в лизисен буфер (Cell Signaling Technology, BIOKÉ, Leiden, Холандия), допълнен с коктейл от 1% протеазен инхибитор (Roche Diagnostics). Общо 20 μg протеини се разтварят в буфера на Laemmli, подлагат се на SDS-PAGE при редуциращи и денатуриращи условия и след това се прехвърлят в PVDF мембрани. За имунодетекция са използвани следните антитела: анти-фосфо-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204), анти-фосфо-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) и анти-фосфо-p38MAPK (Thr180/Tyr182), Всяко антитяло се използва в съответствие с инструкциите на производителя (Cell Signaling Technology, BIOKÉ). Сигналите бяха открити чрез повишена хемилуминесценция. Интензитетите на лентите бяха количествено определени чрез сканираща денситометрия (Gel-Doc2000, Bio-Rad Laboratories, Ltd., Hemel Hempstead, UK), анализирани с Quantum One (Bio-Rad Laboratories Ltd.) и нормализирани към актиновата лента (Sigma-Aldrich, Bornem, Белгия). интензивност.

Представяне на резултатите и статистически анализ

Резултатите са представени като средни стойности ± sem за посочения брой пациенти. Сравнението на различни условия в една и съща група беше извършено с помощта на двустранен t-тест на Student (две условия) или повтарящ се дисперсионен анализ (няколко условия), последван от теста на Dunnett или Newman-Keuls, според случая. Разликите се считат за статистически значими при Р 27, те също са регулирани (приблизително + 78%; Фигура 1). По-нататък изследвахме ефектите на римонабант върху няколко други адипокини, идентифицирани преди това като свръхпродуциращи ОАТ при човешко затлъстяване 18: три хемокини (онкогенен фактор, свързан с растежа, регулиран след активиране на експресирани и секретирани нормални Т клетки, възпалителен протеин на макрофаги (MIP)). -1р), един интерлевкин (IL-7), един инхибитор на тъканна металопротеиназа (TIMP-1) и един хематопоетичен растежен фактор (тромбопоетин). Експресията на MIP-1β и IL-7 беше регулирана от Rimonabant (приблизително -26% и приблизително -32%, съответно; P

Експресия на гени на адипокини в експланти на човешки ОАТ, лекувани с римонабант. Експланти от индивиди с наднормено тегло OAT се култивират със или без 10-100 nM римонабант (Rim) в продължение на 24 часа. Нивата на адипокин тРНК са количествено определени чрез RTQ-PCR, нормализирани до нива на TBP (използвани като репортерен ген) и са представени като относителна експресия в сравнение с контролните (нелекувани) експланти. Резултатите са средни ± sem за 8-12 индивиди със затлъстяване. * P 27, увеличен както при TIMP-1, докато MIP-1β иРНК е намалена (Фигура 2в).

Производство на адипокин в третирани с римонабант човешки адипоцити и SVC. Зрели адипоцити и SVCs, изолирани от OAT затлъстели индивиди, се култивират със или без 100 nM Rimonabant (Rim) в продължение на 24 часа. Нива на адипокин иРНК ( а, ° С ) са количествено определени чрез RTQ-PCR, нормализирани до нивата на TBP и представени като относителна експресия в сравнение с контролните клетки. Концентрация на ApN в средата ( б ) се измерва чрез RIA и се изразява като ng ml -1. Резултатите са средни стойности ± sem за 12-15 (тРНК) или 18 (секреция на протеин) затлъстели индивиди. * Р

Регулиране на ApN чрез модулация CB1R ( а ) е независим от нивата на сАМР ( б, ° С ). ( а ) CB1R модулация на ApN генна експресия в адипоцити. Адипоцитите се култивират със 100 nM римонабант (Rim) или 1 μM ACEA за 24 часа. Нивата на ApN тРНК са представени като относителна експресия в сравнение с контролните адипоцити. ( б ) Инхибиране на производството на сАМР за стимулирана от римонабант експресия на ApN ген в адипоцити. Адипоцитите се култивират със или без MDL-12330A (20 μM) в продължение на 25 часа, докато Rim (100 nM) се добавя през последните 24 часа. Нивата на ApN тРНК са представени като относителна експресия в сравнение с контролните адипоцити. ( ° С ) Увеличаване на производството на сАМР от Рим и предотвратяване на MDL. За да се измери сАМР, адипоцитите се култивират в среда без серум (2% BSA) със или без 100 nM джанта за 10 минути. Общо 20 μM MDL-12330A бяха добавени 1 час преди обработката на ръба. Нивата на CAMP се измерват с ELISA и се нормализират до съдържание на адипоцитен протеин. Резултатите са средни стойности ± sem за седем ( а ), осем ( б ) и пет ( ° С ) на затлъстели индивиди. * Р 28

По този начин ние изследвахме дали стимулацията на ApN гена с римонабант е резултат от повишени нива на сАМР. Повишеното регулиране на ApN иРНК от Rimonabant не се променя, използвайки инхибитора на аденилат циклазата MDL-12330A (Фигура 3b). Независимо от това, този инхибитор е ефективен, тъй като предотвратява повишаването на нивата на сАМР, причинени от римонабант в адипоцитите (Фигура 3b). Взети заедно, тези данни предполагат, че сАМР може да не участва в регулацията на ЕО на ApN. Освен това блокирахме MAP киназни сигнални компоненти със специфични инхибитори p38MAPK (SB203580), ERK1/2 (PD98059) и JNK (SP60025). Тези инхибитори бяха тествани по време на стимулиране на CB1R сигнализиране. Тази стратегия е избрана, тъй като основното фосфорилиране на компонентите на MAPK е относително ниско и следователно изглежда по-лесно да се установи увеличаване (вместо намаляване) на нивата на фосфорилиране. Нито един от използваните инхибитори самостоятелно не променя експресията на ApN гена (не е показан). Намаляването на експресията на ApN от ACEA е напълно обърнато от селективния инхибитор p38MAPK (P

Накратко, ES директно регулира имунния баланс на OAT при човешкото затлъстяване. По-специално, CB1R блокадата облекчава възпалителното състояние както в адипоцитите, така и в SVC, или чрез увеличаване на производството на ApN и оментин, или чрез намаляване на MIP-1β и IL-7. Регулирането на ApN на ApN частично включва p38MAPK.