огледала

  • елементи
  • абстрактно
  • Основното
  • Материали и методи
  • Проби от ендометриална тъкан и пациенти
  • Екстракция на РНК
  • Обратна транскрипция в реално време и количествена PCR
  • Имунохистохимичен анализ на загубата на експресия на PTEN
  • Статистически анализ
  • резултатът
  • Експресия на микроРНК в клинични проби
  • Панел от MicroRNAs, оптимизирани като биомаркери за рак на ендометриума
  • Статус на PTEN в проби от ендометриална тъкан и асоцииране с експресията на микроРНК
  • дискусия

елементи

  • Рак на ендометриума
  • Генната експресия
  • miRNA

абстрактно

Изследвахме връзката между често дерегулираните микроРНК (miRNAs) и ендометричната патология в опит да намерим най-надеждните miRNAs или комбинации от miRNAs за идентифициране на нормални, хиперпластични и злокачествени тъкани на ендометриума. Също така изследвахме връзката между тези miRNAs и PTEN статуса. Измерихме експресията на шест miRNAs (miR-21, 182, 183, 200a, 200c и 205) в 75 нормални фиксирани, парафинови нормални, хиперпластични и злокачествени ендометриални тъканни блокове, използвайки PCR анализи в реално време, базирани на Taqman. Загубата на експресия на PTEN се оценява в същите тъкани на ендометриума чрез имунохистохимия. Експресията на пет miRNAs (miR-182, 183, 200a, 200c и 205) е значително по-висока при ендометриален карцином (CA) в сравнение със сложна атипична хиперплазия (CAH), проста хиперплазия (SH) и нормална ендометриална тъкан (P 1 Според в туморите на Националния регистър 2, 3, честотата на рак на ендометриума в Корея също се е увеличила значително от 1991 до 2005 г.

Клиникопатологичните и епидемиологични проучвания подкрепят злокачествения потенциал на хиперплазия на ендометриума и концепцията за континуум от пролиферативни жлезисти лезии, които в някои случаи завършват с СА. 4 Точната диагноза и лечението на тези предракови лезии е толкова важно за рака на ендометриума, колкото и за рака на маточната шийка. Класификацията на ендометриалната хиперплазия обаче е неоптимална, като грешки при вземане на проби от кюретаж и субективна класификация по СЗО. 5 Диагностиката на такава предракова ендометриална хиперплазия, особено критериите за цитологична атипия, която представлява значително повишен риск от прогресия до СА, 6, 7, 8, е много субективна сред патолозите и в повечето случаи показва ниска възпроизводимост между интерсерверите 5, 7 резултатите предотвратяват класифицирането на хиперплазия на ендометриума въз основа на СЗО за ефективно насочване на клиничното управление и лечение на пациентите. 5

МикроРНК са малки некодиращи РНК, които участват в развитието на тумора. Те регулират експресията на целевия ген чрез разграждане на иРНК или транслационна репресия. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 Всяка микроРНК (miRNA) обикновено може да регулира до стотици целеви гени. 9, 17 По време на развитието на тумора анормалната експресия на miRNA може или да деактивира туморни супресорни гени, или да активира онкогени, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, като по този начин насърчава образуването на тумор. 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18 Тъй като експресията на miRNA е тъканно специфична, 10 откриваема в кръвта 19 и корелира с клиничното поведение за рак, 20 miRNAs са потенциално ценни биомаркери.

Доскоро няколко проучвания идентифицираха или регулирани, или понижени регулирани miRNAs в проби от ендометриална тъкан. Те използваха метода за глобално профилиране 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или кандидатстващия miRNA подход 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 и показаха, че аберантната експресия на miRNA е свързана с хистология на тумора, като реагира 26, 27, 28 на стероидна терапия 24 или химиотерапия 29 и оцелее. 21, 22, 25 Въпреки това, повечето проучвания определят експресията на miRNA в нормални ендометриални или ракови тъкани и възможната експресия на miRNA при ендометриална хиперплазия е до голяма степен неизвестна.

Мутации в PTENs са открити в повече от 20% от хиперплазиите, със или без атипия, и в 30-80% от CAs на ендометриума, което предполага, че промените в PTEN се появяват в относително ранен стадий на ендогенната туморогенеза. 4 Характеризирането на сложната връзка между miRNA и целевия ген PTEN при лезии на ендометриума може да помогне за по-нататъшно дефиниране на някои от молекулярните пътища, които задвижват канцерогенезата. Ето защо решихме да търсим диференциална експресия на шестте miRNAs, които са най-често докладвани при рак на ендометриума 21, 22, 23, 25, 27, 28, 29, 31, 36 и PTEN в различни ендометриални тъкани, за да разберем ендогенната канцерогенеза и тези експресионни профили. се използват в патологичната диагностична област. Тези биомаркери биха спомогнали за увеличаване на възпроизводимостта на ендометриалната хиперплазия и също така да подобрят дискриминацията между сложна атипична хиперплазия (CAH) и CA на ендометриума. Тези профили на експресия на биомаркери могат да се очакват за идентифициране на пациенти с ендометриална хиперплазия, които имат съпътстваща CA или са изложени на риск от развитие.

Материали и методи

Проби от ендометриална тъкан и пациенти

Получени са общо 75 архивни фиксирани с формалин, вградени в парафин (FFPE) тъканни блокове на нормален ендометриум (10 случая), проста хиперплазия (SH, 21 случая), CAH (22 случая) и CA на ендометриума (22 случая). Патологичният отдел на болница „Св. От 22 CA, 16 са били инвазивни за миометрията с 15 пациенти в заместител на IA, 5 в заместител на IB и 2 в заместител на IIIC1, в съответствие със стандартите на Международната федерация по гинекология и акушерство.

Хистологичните диагнози са изследвани от двама независими патолози. Нормални тъкани са получени от пациенти, които са имали хистеректомия за доброкачествени патологични находки на матката, като лейомиом, аденомиоза или пролапс на матката. За това проучване са използвани само тъканни блокове с над 80% хиперплазия или съдържание на СА. В случай на ендометриални CAs, ние избрахме само добре диференцирани (степен 1), ендометриални типове на ендометриални CAs, защото те са основните цели, които трябва да разграничим от CAHs.

Екстракция на РНК

Общата РНК от FFPE тъкани беше извлечена с помощта на комплекта за екстракция на обща нуклеинова киселина RecoverAll (Ambion, Тексас, САЩ) съгласно протокола на производителя. Концентрацията и чистотата на РНК се определят с помощта на UV спектрофотометър.

Обратна транскрипция в реално време и количествена PCR

Обратната транскрипция в реално време и количествената PCR бяха извършени за следните miRNAs: miR-205, miR-183, miR-200c, miR-200a, miR-182 и miR-21 с помощта на комплект за обратна транскрипция TaqMan MicroRNA и анализи TaqMan. . в три екземпляра (Applied Biosystems, Фостър Сити, Калифорния, САЩ). U6 малък ядрен 2 (RNU6b) е използван за нормализиране на входящата обща малка РНК. Абсолютното количествено определяне за всяка miRNA, както и RNU6b се извършва, като се използва стандартна крива, генерирана чрез серийно разреждане на обратно транскрибираната обща РНК, извлечена от VK2 клетки и експресията на всяка miRNA е представена като съотношение между miRNA и RNU6b (RQ).

Имунохистохимичен анализ на загубата на експресия на PTEN

Статистически анализ

Тестът на Kruskal-Wallis е използван за сравняване на RQ на експресията на miRNA по отношение на патологичните находки на пациентите. Като стандартна справка беше използвана патологична диагностика. Изградена е характерна крива приемник-оператор и са избрани граничните стойности за всяка miRNA и композитния miRNA панел, което дава висока обща точност. Чувствителността и специфичността при разграничаване на CA от други тъкани и CA от CAH бяха изчислени за всяко ограничение. Площта под кривата, характерна за работата на приемника (AUC), също беше оценена. За да определим най-добрия композитен miRNA панел, използвахме информационни критерии Akaike, които определят най-подходящия модел въз основа на тест за вероятност и броя на параметрите на модела. Разликата в експресията на PTEN между патологичните групи беше тествана чрез χ2 тест, а разликата в експресията на miRNA между PTEN проби и експресорни проби беше тествана чрез теста на Mann-Whitney. Статистическата значимост за всички анализи се определя от двустранното 0,05 ниво на тест.

резултатът

Експресия на микроРНК в клинични проби

Експресионните нива на петте miRNAs (miR-182, 183, 200a, 200c и 205) са значително по-високи при CA на ендометриума в сравнение с CAH, SH и нормалната ендометриална тъкан (P

( а - е ) Нивата на експресия на miRNA-182, 183, 200a, 200c и 205 са значително по-високи при ендометриален карцином (CA) в сравнение с нормалния ендометриум (n1), единична хиперплазия (SH) или сложна хиперплазия. Хоризонталната линия показва средната стойност. * Р

( а - ж ) Крива на характеристиките на приемника и оператора (ROC) на кривата на нивото на експресия на miRNA. Площта под ROC кривата (AUC) за всяка miRNA показва нейната точност при разграничаване на рак на ендометриума от ендометриална хиперплазия или нормален ендометриум. Всички P стойности

( а - ж ) Крива на характеристиките на приемника и оператора (ROC) на кривата на нивото на експресия на miRNA. Площта под ROC кривата (AUC) за всяка miRNA показва нейната точност при разграничаване на ендометриалния карцином от сложната атипична хиперплазия. Всички P

а - д ) Имунохистохимична загуба на PTEN в а ) нормален ендометриум (загуба на PTEN, хетерогенен); б ) проста хиперплазия (загуба на PTEN, хетерогенна); ( ° С ) сложна атипична хиперплазия (загуба на PTEN, отрицателна); а ( д ) ендометриален карцином (загуба на PTEN, отрицателна). Бялата стрелка показва представителна PTEN-нулева жлеза, а черната стрелка показва представителна PTEN-експресираща жлеза.

Изображение в пълен размер

Изненадващо открихме значителни разлики между нормалната ендометриална или хиперпластична тъкан и CA на ендометриума в пет от шестте miRNAs. По-висока експресия на miR-182, 183, 200a, 200c и 205 се наблюдава при ендометриална СА в сравнение с CAH, SH и нормална ендометриална тъкан. И шестте miRNAs показаха статистически различна сила между CA на ендометриума и други видове тъкани, като miR-183 показва по-специално чувствителност и специфичност над 80%. Също така установихме, че съставният панел от шест miRNAs е статистически най-добрият биомаркер.

От клинична гледна точка в някои случаи е особено трудно да се направи разлика между CAH и CA ендометриум и правилната патологична диагноза е от решаващо значение при лечението на тези пациенти. В нашето проучване пет от шестте miRNAs показват по-висока експресия в CA на ендометриума в сравнение с CAH. Въз основа на AUC анализ, отделните miRNAs са показали, че са по същество информативни. Въпреки това, композитен панел от четири miRNAs, състоящ се от miR-182, 183, 200a и 200c, е най-добрият комбиниран биомаркер за разграничаване на ендометриалния CA от CAH.

Поради високата си чувствителност и специфичност над 90%, той може да се използва като допълнителен диагностичен инструмент в сложни случаи.

PTEN е потвърдена цел на miR-219, 41 и прогнозирана цел на miR-200c и 183. Прогнозираните цели са изследвани с //microrna.sanger.ac.uk/sequences. 21 Няколко проучвания съобщават, че моделите на имунохистохимична експресия на PTEN са полезни като диагностични маркери за разграничаване между нормален, хиперпластичен и неопластичен ендометриум. 8, 42, 43 Pavlakis et al. 44 предполага, че загубата на PTEN и ядрената атипия на EIN при биопсии на ендометриума могат да предскажат съществуването на едновременни CA на ендометриума. Някои други проучвания обаче не показват, че липсата на експресия на PTEN има специфичност и възпроизводимост, за да бъде клинично полезна като биомаркер. 7, 45, 46 Поради това решихме да определим ролята на гена на супресор на тумора PTEN в туморите на ендометриума и връзката с промените в miRNA, включително специфични miRNAs, за които се смяташе, че са насочени към гени за супресор на тумори на PTEN. 9, 21

В това проучване процентът на загуба на PTEN, включително PTEN-отрицателни и хетерогенни случаи, е значително по-висок в CA и CAH ендометриума в сравнение с SH и нормалния ендометриум. Интересното е, че miR-200c е значително увеличен в различни PTEN-отрицателни ендометриални тъкани. Въпреки това, въз основа на нашите данни, които показват несъответствие между загубата на PTEN и експресията на miR-200c в CAH, различен механизъм или miRNA могат да бъдат включени в процеса на загуба на PTEN в ендогенния канцерогенен път. Въпреки че PTEN е потвърдена цел за miRNA-21 и се смята, че miRNA-21 участва в патогенезата на ендометриоза 24, 47 и естрогенната рецепторна мрежа, изглежда, че miRNA-21 не участва в ендогенната туморогенеза в нашето проучване.,

Няма доклад за използването на miRNA и PTEN експресионни профили за хистопатологична диференциална диагноза между проста CAH и ендометриална CA. Надяваме се, че експресионните профили на тези биомаркери биха могли да ни помогнат да изберем една от няколко категории лезии на ендометриума с по-голяма сигурност, особено при разграничаване на CAH и добре диференцирани CA на ендометриума.