предпазва

  • абстрактно
  • Основното
  • МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
  • Лечение на животни
  • CIH индукция
  • Замяна на лептин
  • Измерване на аланин аминотрансфераза
  • хистология
  • ТУНЕЛ Оцветяване
  • Маслено червено O багрило
  • Анализ на плазмените цитокини
  • Извличане на РНК и обратна транскрипция
  • PCR в реално време
  • Имуноблот анализ
  • Определяне на електрофоретична подвижност
  • Статистически анализ
  • РЕЗУЛТАТИТЕ
  • Лечението с ConA увеличава натрупването на мазнини в черния дроб
  • Дефицитът на SCD1 предпазва мишките от CIH
  • Дефицитът на SCD1 потиска възпалителните молекули в патогенезата на CIH
  • Недостигът на SCD1 потиска NF-kB B и STAT1 транскрипционните пътища
  • Намалените нива на лептин медиират резистентност към CIH при мишки с дефицит на SCD1
  • ДИСКУСИЯ

абстрактно

Имунитетът и метаболизмът са тясно свързани. Черният дроб е важен метаболитен орган в тялото. Взаимодействията между хепатоцитите и имунната система обаче са слабо разбрани. Мишки, които са развили индуциран от конканавалин А (ConA) (CIH) хепатит, са открили широко липидно натрупване в хепатоцитите. Регулиран е критичен ензим, участващ в синтеза на мазнини, като стеароил-КоА десатураза 1 (SCD1). Когато инжектирахме ConA в мишки с дефицит на SCD1, установихме, че тези мишки са силно устойчиви на CIH. Механизмите на защитния ефект на дефицита на SCD1 могат да се отдадат на намалени нива на лептин при тези мишки, които модулират критични цитокини и сигнални пътища в патогенезата на CIH. В заключение, нашето проучване предполага, че дефицитът на SCD1 предпазва мишките от зависещо от лептин увреждане на черния дроб.

Основното

Натрупаните доказателства показват, че имунният и енергийният метаболизъм са тясно свързани. Гладуването и недохранването могат да потиснат имунните реакции и да увеличат податливостта към инфекции, докато затлъстяването е свързано със състояние на анормална имунна активност и повишен риск от възпалителни заболявания. 1 Черният дроб е най-големият и най-важен метаболитен орган в тялото. Той преработва основните категории хранителни вещества след усвояването им от храносмилателния тракт и съхранява гликоген, мазнини и витамини. През последните години ролята на черния дроб като основен имунен орган все повече се признава. 2

Имунните клетки, включително Kupffer клетки и лимфоцити, съставляват приблизително 45% от общите нехепатоцитни клетки на нормалния черен дроб. 3 Тези клетки играят решаваща роля в защитата на имунната система срещу нахлуващи патогени. Мишките с чернодробна стеатоза, индуцирана с високо съдържание на мазнини, показват намален дял на естествените Т-клетки-убийци (NKT клетки) в черния дроб и са податливи на индуцирано от липополизахарид (LPS) увреждане на черния дроб. 4, 5 В допълнение, при хепатостеатотични мишки, които развиват индуциран от конканавалин А (ConA) (CIH) хепатит, диференциацията на Т-клетките се измества значително към профила Th1. Освен това при хепатостеатотични мишки са наблюдавани тежки чернодробни увреждания и висока продукция на противовъзпалителни цитокини, включително фактор на туморна некроза α (TNF-α) и интерферон-y (IFN-y). Следователно метаболитните синдроми са предложени като рискови фактори за имунно-медиирано възпаление и увреждане на черния дроб. Въпреки това, начинът, по който възпалението засяга липидния метаболизъм в черния дроб и взаимодействията между имунните клетки и хепатоцитите, все още е слабо разбран.

При нашето изследване на CIH при мишки, ние наблюдавахме голямо натрупване на липиди в хепатоцитите. Критичният ензим, участващ в синтеза на мазнини, стеароил-КоА десатураза 1 (SCD1), е значително регулиран. В опит да индуцираме CIH при мишки с дефицит на SCD1, установихме, че тези мишки са силно устойчиви на CIH. След това бяха изяснени механизмите, водещи до CIH резистентност при мишки с дефицит на SCD1. Нашите резултати добавят допълнителни преки доказателства, че хепатостеатозата значително влияе върху имунните реакции в черния дроб. Ето защо предлагаме да се проучи допълнително модулацията на метаболизма на мазнините като потенциална стратегия за намеса и лечение на възпалителни чернодробни заболявания.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Лечение на животни

Мъжки мишки C57BL/6 на възраст от 8 до 10 седмици са закупени от Shanghai SLAC Laboratory Animal CO LTD (Шанхай, Китай). Ab Xyk мишки (кръстосани на Balb/c мишки, поколение F2) със спонтанна SCD1 дисфункция са описани по-рано. 7 Мишки бяха настанени в съоръжения за животни в Шанхайския институт по биологични науки, Китайска академия на науките, в условия, свободни от патогени, в съответствие с насоките на Комитета по институционални грижи и употреба на животните. Мишките бяха хранени ad libitum със стандартна лабораторна диета за храна за животни, предоставена от SLAC Laboratory Animal CO LTD.

CIH индукция

Мишките бяха инжектирани с единична вена (15 mg/kg телесно тегло) на ConA опашна вена, за да се създаде CIH модел.

Замяна на лептин

Ab Xyk/ab Xyk мишки получават 1 mg/kg рекомбинантен миши лептин (R&D Systems, MN, USA) или PBS чрез интраперитонеална инжекция два пъти дневно в продължение на 5 дни. Впоследствие ConA се инжектира във всички мишки.

Измерване на аланин аминотрансфераза

Плазмата е получена приблизително 17 часа след инжектирането на ConA. Нивата на аланин аминотрансфераза (ALT) бяха определени с помощта на комплект за откриване на ALT (Shanghai Yihua Medical Science & Technology, Шанхай, Китай) в съответствие с инструкциите на производителя.

хистология

Черният дроб беше отстранен след перфузия с PBS, фиксиран с 4% фосфатно буфериран параформалдехид и вграден в парафин. Приготвят се тъканни срезове (5 μm), оцветяват се с хематоксилин и еозин (H&E) и се изследват чрез светлинна микроскопия. За всяко животно бяха анализирани общо 10 тъканни среза.

ТУНЕЛ Оцветяване

ДНК фрагментацията се анализира в вградени в парафин чернодробни тъкани, като се използва терминална дезоксинуклеотидилтрансфераза-медиирана dUTP-биотин реакция на етикетиране на никелов край (TUNEL) в съответствие с инструкциите на производителя (Roche Molecular Biochemicals, IN, USA). След това срезовете бяха изследвани чрез светлинна микроскопия. Бяха анализирани общо 10 тъканни среза за всяко животно.

Маслено червено O багрило

Замразените чернодробни срезове (8 μm) се оцветяват с Oil Red O (Sigma, MO, USA) в продължение на 10 минути и след това се оцветяват с хематоксилин в продължение на 45 s. След това срезовете бяха изследвани чрез светлинна микроскопия. Бяха анализирани общо 10 тъканни среза за всяко животно.

Анализ на плазмените цитокини

Плазмените концентрации на TNF-α, IFN-γ и лептин се определят, като се използват специфични комплекти за имуносорбентен анализ, свързани с ензими (R&D системи), съгласно инструкциите на производителя.

Извличане на РНК и обратна транскрипция

Обща РНК беше изолирана от клетъчни пелети и чернодробни тъкани с помощта на RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия). Геномната ДНК беше отстранена от общата РНК преди синтеза на cDNA, използвайки комплект без ДНКаза DNK за ​​разцепване на DNase по време на пречистване на РНК (Qiagen). РНК се съхранява при -80 ° С. Синтезът на първа верига на cDNA се извършва за всяка РНК проба, като се използва Sensiscript RT Kit (Qiagen). Случайни хексамери са използвани за приготвяне на синтез на cDNA.

PCR в реално време

Извършена е генна експресия на индуцируема азотна оксидна синтаза (iNOS), индуциран от интерферон протеин 10 (IP-10), моноцитен хемотактичен протеин-1 (MCP-1), макрофагичен възпалителен протеин-1a (MIP-1a), SCD1 и лептин мРНК чрез PCR в реално време, използвайки SYBR Green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Условията на термоциклера включват начален период на задържане при 50 ° С за 2 минути, след това при 95 ° С за 10 минути. Това беше последвано от двустепенна PCR програма, състояща се от 95 ° С за 15 s и 60 ° C за 60 s за 40 цикъла. Данните бяха събрани и анализирани количествено, използвайки система за откриване на последователност ABI Prism 7900 (Applied Biosystems). Β-актинът се използва като ендогенен контрол за нормализиране на разликите в количеството на общата РНК във всяка проба. Всички количества са изразени като кратни спрямо експресията на β-актин. β-актин:

Имуноблот анализ

Анализът на имуноблот се извършва, като се използват проби от екстракт от цели чернодробни клетки, разделени чрез електрофореза върху 10% SDS-полиакриламиден гел и прехвърлени в PVDF мембрана. STAT1, фосфо-STAT1 (Thr-701), STAT3 и фосфо-STAT3 (Tyr-705) бяха визуализирани с помощта на антитяло от BD Bioscience (CA, USA).

Определяне на електрофоретична подвижност

Чернодробни екстракти от чернодробни тъкани се приготвят, както е описано по-горе. 8-NF-кВ свързващ консенсус едноверижен олигонуклеотид (5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3 ') беше хибридизиран за първи път с комплементен олигонуклеотид (5'-GCCTGGGAAAGTCCCTCAACT-3'). Отгрятият ДНК фрагмент е белязан с [y-32 P] dATP (Amersham, Piscataway, NJ, USA), като се използва Т4 полинуклеотидна киназа (Promega, Madison, WI, USA). Ядрените протеини (15 μg) се инкубират с 2.5 ng32P-маркирани двуверижни олигонуклеотидни сонди за 30 минути при стайна температура. Сместа се отделя чрез електрофореза върху 4% полиакриламидни гелове с 0,5 х трис-борат-етилендиаминтетраоцетна киселина буфер при 4 ° С.

Статистически анализ

Всички резултати бяха изразени като средно ± sd. Статистическите сравнения между двете групи бяха извършени с помощта на t-тест на Student след дисперсионен анализ. Нивото на значимост беше определено на a = 0,05. Всички тестове бяха двустранни.

РЕЗУЛТАТИТЕ

Лечението с ConA увеличава натрупването на мазнини в черния дроб

CIH е широко използван животински модел на имунно-медиирано увреждане на черния дроб и може да бъде предизвикан чрез интравенозно инжектиране на ConA на мишки. Установихме, че натрупването на мазнини в хепатоцитите се наблюдава още 2 часа след инжектирането на ConA, както е показано с оцветяване с Oil Red O (Фигура 1а). Междувременно критичният ензим, участващ в синтеза на мазнини, SCD1, беше регулиран (Фигура 1b). Също така открихме, че други ключови липогенни гени, включително синтаза на мастни киселини, ацетил-КоА карбоксилаза 1 и Elov16, показват подобен модел на експресия на SCD1 (Фигура 1b). По този начин, в началната фаза на индукция на CIH, заедно с развитието на увреждащи тъканите имунни отговори, настъпи повишен синтез и натрупване на мазнини.

Липидно натрупване при CIH. Четири групи мишки C57BL/6 (n = 5) получиха инжекция на ConA (15 mg/kg) през вената на опашката. а ) Показани са представителни микрофотографии, показващи оцветяването на чернодробни секции с маслено червено. Повишена мастна тъкан (червена) в хепатоцитите 2 - 24 часа след инжектиране на ConA в сравнение с почивка (0 часа). ( б ) Експресия на SCD1, FAS, ACC1 и Elov16 в иРНК на черния дроб. Резултатите се отчитат като средно ± sd. Данните са представителни за пет експеримента.

Изображение в пълен размер

Дефицитът на SCD1 предпазва мишките от CIH

SCD1 играе ключова роля в липидния метаболизъм. 9, 10 SCD1-дефицитни мишки показват дефектен синтез на холестерол и триглицериди в черния дроб, 11, 12, като по този начин показват намалена чернодробна стеатоза. Ab Xyk 7 мишки са новохарактеризирани асбиеви мишки със спонтанна дисфункция на мутацията на гена SCD1. Използвахме тези мишки, за да индуцираме CIH. Техните носилки с нормален фенотип (+/+ или +/ab на мишки Xyk, показани като +/a) бяха използвани като контроли.

Четири часа след индукция на CIH се наблюдава значително по-ниска хепатостеатоза при ab Xyk/ab Xyk мишки в сравнение с + /? мишки (Фигура 2а). Серумът се събира 17 часа след приложението на ConA за измерване на ALT, за да се провери тежестта на увреждането на черния дроб. Установихме, че серумният ALT се е увеличил драстично след индукция на CIH в +/-? мишки (9183 ± 1629, U/L), което показва тежко увреждане на черния дроб при тези мишки. Въпреки това, при мишки ab Xyk/ab Xyk, индуцираното от ConA повишаване на серумния ALT беше значително блокирано (88 ± 50, U/L; P при няколко мишки ab Xyk/ab Xyk, бяха наблюдавани само няколко възпалителни или некротични лезии (Фигура 2в). Мишките с дефицит на SCD1 изглеждаха силно устойчиви на CIH.

Мишките с дефицит на SCD1 са устойчиви на индуциран от ConA хепатит. Мишки с дефицит на SCD1 (ab Xyk/ab Xyk) и контролни мишки от постеля (+/a) (n = 5) получиха инжекция на ConA (15 mg/kg) през вената на опашката. Маслено червено O оцветяване на части от черния дроб 4 часа след инжектиране на ConA ( а ). Седемнадесет часа след инжектиране на ConA се получава плазма и се измерват нивата на ALT ( б ). В същото време черният дроб беше отстранен и фиксиран в 4% параформалдехид. Извършено е H&E оцветяване на черния дроб ( ° С ) и TUNEL ( д ) и резултатите бяха изследвани чрез светлинна микроскопия (увеличение × 200). Резултатите се отчитат като средно ± sd. Данните са представителни за пет експеримента. ** P Xyk/ab Xyk много отслабен (Фигура 3а и б). Изследвана е и експресията на няколко основни възпалителни медиатори, включително iNOS, IP-10, MCP-1, MIP-1α, за които се твърди, че са важни в патогенезата на CIH. Установено е, че експресията на всички тези възпалителни медиатори е значително по-ниска при ab Xyk/ab Xyk мишки, отколкото при +/a. мишки след индукция на CIH (Фигура 3c-f).

Наред с натрупването на липиди, открихме повишена експресия на SCD1 в черния дроб на CIH мишки. SCD1 е централен липогенен ензим, който превръща наситените мастни киселини с дълга верига в мононенаситени мастни киселини (MUFA). След това попитахме как CIH ще се прояви при мишки с дефицит на SCD1. Както се очакваше, мишките с дефицит на SCD1 бяха силно устойчиви на CIH, както беше показано чрез измерване на серумния ALT и хистологично изследване на черния дроб. Въпреки че наскоро публикуван доклад показа, че мишките с дефицит на SCD1 показват повишена тежест при модел на остър колит, индуциран от натриев декстран сулфат. Ефектът на дефицита на SCD1 върху имунно-медиираното увреждане на черния дроб е неизвестен. Нашите открития показват, че SCD1, ключов ензим, участващ в метаболизма на мазнините, участва в имунно-медиираното увреждане на черния дроб. След това продължихме да изследваме основния механизъм.

Чудим се как SCD1, ензим за биосинтез на MUFA, може да повлияе на възпалението. Отбелязахме доклад на Ntambi et al., Че производството на лептин е било потиснато при мишки с дефицит на SCD1 при диети и диети с високо съдържание на мазнини. 14 Известно е, че лептинът е критична връзка между енергийния метаболизъм и имунитета. Лептинът засяга пряко или непряко много имунни пътища. Ключови патогенни имунни клетки в CIH, като Т клетки и NKT клетки, могат да бъдат активирани от лептин. Лептинът също така насърчава производството на провъзпалителни цитокини, като TNF-α и IFN-γ, които са от решаващо значение в патогенезата на CIH. 13, 38 Предишно проучване показа, че чувствителността към CIH може да се увеличи чрез лептин чрез поддържане на голям брой чернодробни NKT клетки, както и чрез посредничество на Т-клетъчно активиране и производство на цитокини. Следователно затлъстяването и метаболитният синдром биха изложили черния дроб на повишен риск от имунно-медиирано увреждане от лептин-зависим механизъм. 39 Дефицитът на лептин намалява тежестта на CIH модела. Тук наблюдаваме намалени нива на серумен лептин и експресия на мРНК на лептин в мастната тъкан при мишки с дефицит на SCD1. Експериментът със заместване допълнително потвърди, че намалените нива на лептин значително допринасят за защитната роля на дефицита на SCD1 при индукция на CIH.

Доказано е, че няколко известни регулатора на липидния метаболизъм, които стимулират окисляването на мазнините, включително метформин и омега-3 полиненаситени мастни киселини, имат хепатопротективна активност срещу имунно-медиирано увреждане на черния дроб. 40, 41 В това проучване ясно показахме, че инактивирането на SCD1, ключов регулатор на липидния метаболизъм, предпазва мишките от CIH. Подобни защитни ефекти се наблюдават след предварителна обработка на мишки с метформин AMPK активатор (нашите непубликувани данни). Нашите открития предоставят пряко доказателство, че регулирането на енергийния метаболизъм може да промени имунните реакции в черния дроб. Това предполага нов подход за разбиране и евентуално контролиране на кръстосани взаимовръзки между енергийния метаболизъм и имунната система в черния дроб. Такъв подход може да помогне и подобри лечението на чернодробни заболявания в бъдеще.