предизвикана

  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Мащабираната клетъчна метаплазия се развива в белите дробове на хронично заразени MTB мишки
  • Скоростта на плоскоклетъчната метаплазия се контролира генетично
  • Плоскоклетъчните метаплази водят до злокачествена трансформация
  • Фактори, предразполагащи към плоскоклетъчни карциноми, присъстват при туберкулозни белодробни лезии
  • дискусия
  • Конфликт на интереси
  • Допълнителна информация
  • Word документи
  • Приложение 1

абстрактно

Туберкулозата (ТБ) остава една от водещите причини за смърт от инфекциозни заболявания и представлява глобална заплаха за общественото здраве. Вирулентната Mycobacterium tuberculosis (MTB) е причина за повече от 2 милиона смъртни случая в световен мащаб годишно, като приблизително една трета от човешката популация носи патогена в скрита форма. Резултатите от туберкулозната инфекция варират от първично прогресиращо заболяване, което се среща при по-малко от 10% от заразените индивиди, до латентна инфекция, която може да доведе до реактивиране на болестта много години след първичната инфекция или да остане субклинична за живота на заразените индивиди. Белодробната туберкулоза се развива в ∼ 85% от клиничните случаи и е най-епидемиологично значимата форма на заболяването. Способността на патогена да причинява деструктивно белодробно заболяване при имунокомпетентни гостоприемници позволява ефективното му предаване през дихателните пътища в човешката популация. Разбирането на процеса, иницииран от патогена в белите дробове, е от ключово значение за дешифрирането на неговата еволюционна успешна стратегия за вирулентност и разработването на ефективни интервенции за контрол на заболяванията. Характеристиките на туберкулозните лезии в белите дробове, които ги отличават от грануломите в други органи, остават неизвестни.

Съвместното съществуване на белодробна туберкулоза и карцином е описано от много патолози от първия доклад на Bayl през 1810 г. (Sakuraba et al., 2006; Tan and Coussens, 2007). Оттогава се предполага, че белодробната туберкулоза може да съществува едновременно с различни хистологични видове рак на белия дроб. Например е документирана тясна връзка на метастатичен плоскоклетъчен карцином (SCC) на белия дроб с лезии с големи туберкулозни кухини (Oka и Chan, 2005). Изследване на Dacosta и Kinare в Индия съобщава, че туберкулозни лезии, активни или лечебни, са открити в белите дробове на 30-33% от пациентите с бронхогенни тумори, в сравнение със 7% в общата популация (Dacosta и Kinare, 1991). Курасава също съобщава за по-високи нива на съвместно съществуване на белодробна туберкулоза и рак на белия дроб, което беше представено главно от SCC в това проучване (Kurasawa, 1998). Наблюдавани са прекомерно високи нива на смъртност от рак на белия дроб както при пушачи, така и при непушачи с туберкулоза при аутопсии (Sakurai et al., 1989). Клиничната диагноза на съжителствения туберкулозен и белодробен рак е предизвикателство и често има значително забавяне в прилагането на адекватно лечение и за двете състояния, което е свързано с лоша прогноза (Gopalakrishnan et al., 1975; Ting et al., 1976 ).

Причинната връзка между рака на белия дроб и белодробната туберкулоза не е ясна. От една страна, хроничната възпалителна реакция, свързана със скрита туберкулозна инфекция, може да служи като причина за злокачествено заболяване. Тази възможност косвено се подкрепя от наблюденията на т.нар „Белези по белези“ (Cagle et al., 1985). Арди предполага, че в много случаи белодробните белези са възникнали поради спонтанно излекуване след повтаряща се туберкулозна инфекция и инициирането на цикли на възпалителни и тъканни възстановителни процеси създава благоприятна среда за туморогенеза (Ardies, 2003). От друга страна, ракът на белия дроб може да се развие автономно и след това да предизвика реактивиране на латентна туберкулоза чрез отслабване на местния имунитет. Това също е вероятен сценарий, тъй като почти една трета от човешката популация е латентно заразена с MTB. Следователно причинно-следствената връзка не може да се изведе единствено от клиничните корелации. Междувременно това разграничение е от решаващо значение за демонстриране на специфичните молекулярни механизми, лежащи в основата на съвместното съществуване на туберкулозата с рака и разработването на рационални превантивни и терапевтични мерки.

В това проучване представяме експериментални доказателства, че хроничната туберкулозна инфекция в белия дроб е достатъчна, за да предизвика многоетапна трансформация на клетки, свързани с туберкулозни лезии на туберкулозата чрез плоскоклетъчна дисплазия до злокачествен SCC. Ние показахме, че освен увреждащите ДНК реактивни кислородни видове и азот, заразените с MTB макрофаги произвеждат и най-силния член от семейството на епидермалния растежен фактор епирегулин, който може да служи като паракринен растежен фактор в началните етапи на туморогенезата. В нашия модел ние също така идентифицирахме мощен генетичен модификатор на индуцирана от MTB белодробна туморогенеза: генетичният локус sst1 (Kramnik et al., 2000), който специално контролира увреждането на тъканите и прогресията на туберкулозата в белия дроб.

резултатът

Мащабираната клетъчна метаплазия се развива в белите дробове на хронично заразени MTB мишки

Първоначални клъстери на SCC-подобни клетки се наблюдават в белите дробове на F2 потомство с относително устойчиви на TB (C3HeB/FeJxB6.C3H-sstl) F2 след iv MTB инфекция. В тази податлива, но иначе генетично хетерогенна популация sst1, оцеляването варира от 5 до 6 седмици за повече от една година. Седем дългосрочно оцелели са убити 15 месеца след инфекцията. Живи MTBs бяха открити в белите дробове чрез прилагане на хомогенати на органи. При хистопатологично изследване открихме клъстери от необичайни големи клетки, наподобяващи сквамозни клетки при четири от седемте животни, които бяха здраво прикрепени една към друга и съдържаха големи атипични ядра. Тези клъстери са в непосредствена близост до големи възпалителни лезии, но са ясно различни от околните възпалителни клетки (Фигура 1а, стрелки). Тези клетки оцветяват положително за цитокератини 5, 6 и 14 и заемат големи съседни области на белия дроб (Фигура 1b), докато оцветяването за цитокератини 1, 8 и 10 е отрицателно (данните не са показани).

Люспести клетки в белите дробове на хронично заразени MTB мишки. а ) плоскоклетъчен карцином в белия дроб на генетично резистентна (C3HeB/FeJ × B6.C3H-sstl) F2 хибридна мишка 15 месеца след MTB инфекция. Оцветяване на белодробни секции с хематоксилин и еозин (H&E). Стрелки - клъстери от сквамозни клетки. Оригинално увеличение - × 40, × 200 и × 600 (ляв, среден и десен панел). ( б ) Имунохистохимичен анализ на белодробна тъкан на мишка F2 с използване на анти-цитокератин 5 (ляв панел), анти-цитокератин 6 (среден панел) и анти-цитокератин 14 (десен панел) антитела. Оригинално увеличение - × 200. ( ° С ) Белодробни участъци от вроден щам на мишка B6.C3H-sst1, възприет на sst1 5 месеца след MTB аерозолна инфекция, двойно оцветяване за цитокератин 6 (ляв и среден панел, първоначално увеличение - × 40 и × 400) (съответно) и устойчиви на киселини микобактерии (десен панел, × 400). ( д ) Масивна фиброза, свързана с некротична белодробна лезия на мишки B6.C3H-sstl (стрелки). Трихромно оцветяване, оригинално увеличение - × 40 и × 200, ляв и среден панел. Десен панел - голям клъстер от сквамозни клетки в белодробна туберкулозна лезия. H&E, оригинално увеличение - × 400.

Изображение в пълен размер

По-нататък изследвахме дали типичните некротични белодробни туберкулозни лезии, които се развиват при мишки B6.C3H-sst1 след ниска доза аерозолна инфекция, развиват плоскоклетъчна дисплазия. Пет месеца след MTB инфекция бяха открити големи клъстери от цитокератин 6-положителни клетки на ръба на периферните туберкулозни лезии (Фигура 1в, ляв и среден панел) в непосредствена близост до централната некротична област, съдържаща микобактерии (Фигура 1в, десен панел)., десен панел) и бяха заобиколени от масивна фиброзна тъкан (снимка ld, ляв и среден панел).

И в двата експеримента нашата предварителна диагноза е плоскоклетъчна метаплазия на алвеоларни клетки с възможна злокачествена трансформация.

Скоростта на плоскоклетъчната метаплазия се контролира генетично

Сравнихме появата на метапластични клетки при туберкулозни белодробни лезии на следните щамове на мишки: C3HeB/FeJ (TB-чувствителен щам, носещ оригиналния забележим алел на локуса sst1), sst1 вроден B6.C3H-sstl. (умерена TB чувствителност) и C57BL/6J (устойчива). Както е показано на Фигура 2, след аерозолна инфекция с вирулентен MTB с ниска доза, тези щамове се различават по оцеляването си (Фигура 2а), способността им да контролират пролиферацията на MTB в белите дробове (Фигура 2b) и степента на пневмония (Фигура 2в, показана 4 месеци след заразяването).). Появата на сквамозни клетки се наблюдава в белите дробове на мишки, заразени с MTB, чрез имунооцветяване със специфични за цитокератин 6 антитела, което позволява по-чувствителна идентификация на сквамозните клетки при сложни туберкулозни лезии. Използвайки тази техника, не са открити сквамозни клетки в белите дробове на незаразени мишки от какъвто и да е щам (не е показано).

Мащабирана клетъчна метаплазия по време на туберкулозна инфекция при устойчиви на MTB щамове на мишки. а ) Криви на оцеляване на щамове мишки C3HeB/FeJ, B6.C3H-sstl и C57BL/6J след ниска доза аерозолна инфекция на 30-50 CFU MTB от щам Erdman. ( б ) микобактериално натоварване в белите дробове на миши щамове C3HeB/FeJ, B6.C3H-sstl и C57BL/6J, както се определя чрез прилагане на белодробни хомогенати (CFU - образуващи колонии единици). ( ° С ) възпалителни лезии на белите дробове 4 месеца след аерозолна инфекция (H&E, първоначално увеличение - × 40 за горните панели; × 100 за долните панели). ( д ) Анализ на положителни клетки на цитокератин 6 при белодробни туберкулозни лезии на мишки C3HeB/FeJ, B6.C3H-sst1 и B6 (ляв, среден и десен панел) 4 месеца след инфекцията (първоначално увеличение - × 100),

Изображение в пълен размер

Маса в пълен размер

Изображение в пълен размер

Като цяло нашите данни показват, че развитието на плоскоклетъчна метаплазия е често срещана характеристика на хроничната туберкулозна инфекция в белите дробове, докато няма плоскоклетъчни клетки, свързани с MTB-заразени клетки в далака и черния дроб на нито един етап от инфекцията (данните не са показани ). ).

Плоскоклетъчните метаплази водят до злокачествена трансформация

Въз основа на морфологични критерии, плоскоклетъчната метаплазия може да прогресира до образуване на SCC в по-късните етапи на инфекцията (Фигура 1). За да оценим пролиферативната активност на клетки, свързани с метапластични лезии, използвахме фосфорилирани хистон 3-специфични антитела, които разпознават митотични клетъчни ядра (Hendzel et al., 1997; Inagaki et al., 1997; Preuss et al., 2003). На 7 месеца след инфекцията голяма част от клетките, тясно свързани с типични клъстери от цитокератин 6-положителни клетки, показват подчертано оцветяване на ядрен хистон 3 (Фигура 3b). Това се наблюдава при метапластични белодробни лезии на мишки C57BL/6J и B6.C3H-sstl (Фигура 3b, ляв и десен панел).

Тъй като 80% от мишките C57BL/6J показват признаци на плоскоклетъчна метаплазия 12 месеца след инфекцията, някои с морфологични признаци на злокачествена трансформация (Таблица 1), ние тествахме туморогенния потенциал на тези клетки директно чрез трансплантация на клетки, изолирани от белите дробове на туберкулозни лезии на реципиенти на синген. Едноклетъчна суспензия се приготвя от белите дробове на пет мишки C57BL/6J 12 месеца след MTB инфекция чрез разграждане на колагеназа и приблизително 10 милиона неразделени белодробни клетки (еквивалентни на един бял дроб) се инжектират в мишки подкожно (пет животни) или интраперитонеално. (пет животни). Мишките са получили изониазидно (INH) анти-туберкулозно лекарство в питейна вода, за да инхибират растежа на MTB. След 2 до 3 месеца клетъчен трансфер, наблюдавахме образуване на тумор при 2 от 10 мишки, получили белодробни клетки, една след подкожна и една след интраперитонеална трансплантация. Като контрола трансплантирахме едноклетъчни суспензии, приготвени от далаци на същите заразени с MTB мишки, в сингенни реципиенти и не наблюдавахме образуване на тумор.

Подкожният тумор е трансплантиран на вторичен реципиент, който също е развил голям тумор на мястото на подкожното инжектиране 2 месеца по-късно (Фигура 3в, горен ляв панел). Към днешна дата са извършени общо три пасажа на интервали от два месеца и не са открити устойчиви на киселина микобактерии при трансплантирани тумори. В сравнение с първичните белодробни тумори, трансплантируемият тумор показва по-малко диференцирана морфология (Фигура 3в, долния ляв панел, H&E) и съдържа по-малко 6-положителни клетки на цитокератин (Фигура 3в, десни панели). По този начин, след прехвърляне към реципиенти на синген, клетките, получени от хронични белодробни лезии на TB, индуцират трансплантируем тумор, който не изисква MTB за своя автономен растеж.

Фактори, предразполагащи към плоскоклетъчни карциноми, присъстват при туберкулозни белодробни лезии

Освен това искахме да определим кои от факторите, които могат да бъдат отговорни за плоскоклетъчната дисплазия, присъстват в микросредата на белодробни туберкулозни лезии. Един от потенциалните фактори за растеж, за който е известно, че е критичен за развитието на SCC, е епирегулинът, мощен член от семейството на епидермалния растежен фактор (Toyoda et al., 1997). Изследвахме експресията на епигегулиновия ген в белите дробове на мишки C57BL/6J по време на MTB инфекция чрез количествена RT-PCR на общата белодробна тъкан. Както е показано на Фигура 4а, експресията на епирегулин е била ниска през първите 6 месеца от инфекцията и е значително повишена до 12 месеца, едновременно с развитието на плоскоклетъчна метаплазия и карциноми.

Изображение в пълен размер

За да се определи дали MTB инфекцията може също да индуцира експресия на епирегулин в макрофаги, макрофаги, получени от костен мозък, са изолирани от щамове C57BL/6J (черни ленти) и щам B6.C3H-sst1 (бели ленти), заразени с MTB in vitro и кинетика mRNA експресия епирегулин се анализира чрез количествена RT-PCR. Както е показано на Фигура 4в, повишено регулиране на еРИПЕГУЛИНОВАТА РНК в щамове C57BL/6J и B6.C3H-sstl, 6 часа след MTB инфекция. Кинетиката на експресия на еРИПЕГУЛИНРНК в инфектирани с MTB макрофаги предполага, че експресията му е индуцирана от първоначалното взаимодействие на макрофагите с MTB, вероятно чрез тол-рецептори.

По-нататък тествахме дали епирегулин се експресира от макрофаги на туберкулозни белодробни лезии in vivo. Две популации от макрофаги, алвеоларни и интерстициални възпалителни макрофаги, бяха изолирани от белите дробове на мишки B6 12 месеца след MTB инфекция. Алвеоларните макрофаги са изолирани чрез бронхоалвеоларен лаваж, а интерстициалните (грануломни) макрофаги са изолирани чрез смилане на интерстициални възпалителни лезии с колагеназа. И в двете популации макрофагите се обогатяват за пластична адхезия в продължение на 2 часа и се извършва цялостно изолиране на РНК без допълнителна стимулация. Интерстициалните макрофаги експресират еРИГУЛИНОВА РНК, докато не се наблюдава експресия на епирегулин в алвеоларни макрофаги (Фигура 4b) По този начин, in vivo, епирегулин се експресира от възпалителни макрофаги в белодробни туберкулозни лезии.

Както е показано на Фигура 4г, MTB-инфектираните макрофаги са основен източник на индуцируема азотна синтеза в ТБ белодробни лезии (горни панели). Реактивните кислородни видове и азотът са силни индуктори на окислително увреждане на ДНК. За да оценим натрупването на клетки, претърпели увреждане на ядрената ДНК в близост до инфектирани с MTB макрофаги, оцветихме туберкулозните лезии с антитела, специфични за фосфорилиран γ-хистон2AX, появата на които в ядрата предполага двуверижни ДНК разкъсвания (Bewersdorf et al., 2006) .; Нусенцвайг и Пол, 2006). Γ-H2AX оцветяването показва, че обилното пробивно ядрено оцветяване на неинфектирани клетки обгражда инфектирани с MTB макрофаги. Тези данни показват, че заразените с MTB макрофаги имат двоен ефект върху клетките в непосредствена близост, защото те са източник на ДНК увреждащи агенти и източник на растежни фактори за оцеляване.

За да определим дали по-високите микобактериални натоварвания или други фактори са отговорни за по-бързото развитие на плоскоклетъчна дисплазия в белите дробове на мишките B6.C3H-sstl, използвахме антимикобактериална химиотерапия с INH за контрол на бактериалния растеж. След двумесечен период на прогресиране на заболяването, INH се прилага в продължение на 3 месеца. В началото на лечението с INH наблюдавахме развитието на некротични лезии и около 500-1000 пъти по-висок бактериален товар в белите дробове на вродени мишки B6C3H-sst1, които са неприемливи за sst1. Понастоящем в белите дробове не са наблюдавани сквамозни клетки. INH терапията намалява бактериалното натоварване в органите на мишките B6.C3H-sst1 до 500 пъти, до нива, които обикновено се наблюдават при нелекувани мишки C57BL/6J. Независимо от това, цитокин 6-положителните метапластични клетки лесно се откриват в белите дробове на две от трите мишки B6C3H-sstI (Фигура 5). При едно животно наблюдавахме напреднали етапи на метаплазия в съседство с големи клъстери от заразени с MTB макрофаги (Фигури 5а-в, 2 леви панела, мишка # 1). Междувременно белите дробове на друга мишка представляват по-ранен етап на метаплазия с малки клъстери от цитокератин 6-положителни клетки, които са свързани с възпалителна тъкан, която не съдържа никакви киселинно-устойчиви бацили (Фигури 5а-в, десни панели).

Дисплазия на люспести клетки, свързана с лезии на белодробна туберкулоза след антимикобактериална химиотерапия с изониазид (INH). Конгенни мишки C57BL/6J и B6.C3H-sstl бяха заразени с 50 000 CFU на MTB. След 2 месеца инфекция животните получават INH в питейна вода (0,1 mg/ml) за още 3 месеца. Животните бяха умъртвени 7 дни след края на INH химиотерапията. Бактериалното натоварване в белите дробове на мишките B6.C3H-sstl варира от 5 х 104 (мишка # 2) до 20 х 104 CFU (мишка # 1) след лечение. По това време MTB е под нивото на откриване (