глутатион

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Активирането на термогенна програма е свързано с намаляване на GSH
  • Изчерпването на GSH чрез лечение с BSO селективно засяга мастната тъкан и предизвиква ремоделиране на нейната форма
  • Лечението с BSO предизвиква покафеняване на мастните клетки и отделяне на митохондриите от Fox01
  • дискусия
  • методи
  • Клетъчни линии, лечения и трансфекции
  • Мишки и лечения
  • Изолиране на митохондрии
  • Определяне на протеиновото карбонилиране
  • Гел електрофореза и Western blot
  • RT-qPCR анализ
  • Определяне на нивата на GSH
  • Митохондриален мембранен потенциал и тест за абсорбция на глюкоза
  • имунохистохимия
  • Консумация на кислород
  • Статистически анализ
  • Повече информация
  • История на промените
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

елементи

Тази статия е актуализирана

абстрактно

Мастната тъкан има множество метаболитни функции и основно участва в регулирането на енергийната хомеостаза. Традиционната номенклатура има мастна тъкан бяла и кафява в зависимост от нейния макроскопичен вид. Бялата мастна тъкан (WAT) се състои от бели адипоцити и обикновено се счита за енергиен резервоар от неутрални липиди. WAT съхранява излишните калории за използване в други тъкани по време на недостиг на хранителни вещества. Кафявата мастна тъкан (НДНТ) е ​​преди всичко мястото на терморегулация. BAT всъщност е окислителна тъкан, която, когато се активира напълно, използва мастни киселини, съхранявани в кафяви адипоцити, за да стимулира активността на отделящия се протеин 1 (Ucp1 или термогенин), който разсейва митохондриалния протонен градиент, за да произвежда топлина.

WAT е в състояние да постигне голяма пластичност и се подлага на непрекъснато преустройство по време на живота в отговор на много стимули на околната среда (лекарства, хранителни вещества и т.н.) и на физиологични условия (например стареене, затлъстяване). Неочакваното присъствие на клетки с характерни кафяви адипоцити е отбелязано в WAT 4, 5. Следователно класификацията на адипоцитите е актуализирана наскоро. По-специално, Brite (кафеникаво-бели) или бежови адипоцити е името, използвано за разграничаване на кафявите клетки, разположени в WAT, от белите и кафявите адипоцити 6, 7. Важно е, че с физиологични стимули като физически упражнения и излагане на студ, WAT може да се развие към кафяв фенотип 8, 9, 10, 11. По време на този процес (покафеняване) експресията на класически гени за НДНТ се задейства в WAT, което увеличава консумацията на енергия и води до загуба на тегло. В резултат WAT покафеняването има положителен ефект върху чувствителността към затлъстяване при затлъстяване, инсулиновата резистентност и хиперлипидемията 2, 12. Въпреки това, патологични състояния като възпаление и рак също причиняват WAT покафеняване 13, 14, 15 .

Съществува и страхотен нов консенсус, че метаболитно активната НДНТ е при хората от новородени до възрастни 16 и по-ниските нива на НДНТ са свързани със затлъстяването и диабета 17, 18. Това поднови интереса към функцията на НДНТ и ефектите от нейното набиране върху цялостния метаболизъм на телесната енергия. Поради това увеличаването на енергийните разходи чрез печене на WAT или активиране на НДНТ е привлекателна цел за намаляване на риска от затлъстяване и свързаните с него патологии 17, 18 .

Сложният път на генната експресия контролира развитието на фенотипа на адипоцитите и метаболитния отговор към специфични входове. Наскоро беше показано, че индуцирането на гени, които организират метаболизма и диференциацията на мастните клетки, се предизвиква от промени във вътреклетъчното редокс състояние 19, 20. В допълнение, редокс потенциалът изглежда модулира ефективността на митохондриалния метаболизъм 21. В това отношение кафявите адипоцитни митохондрии имат по-високо ниво на производство на реактивни кислородни видове (ROS) и по-окислено състояние в сравнение с други клетъчни типове 21. Излагането на студ допълнително измества окислително-възстановителните митохондрии на кафявите адипоцити в прооксидативно състояние и това събитие е необходимо за правилното функциониране на BAT митохондрии 21. Тези наблюдения предполагат много специална характеристика на НДНТ за всички други тъкани, които разчитат на тяхната функция да имат по-редуктивна среда 22, 23 .

Глутатионът (GSH) е основната редокс система на тиолов дисулфид във всички клетъчни типове 24 и промените в неговата концентрация са широко признати за насърчаване на клетъчната диференциация 25. През последните години беше доказано, че много аспекти на физиологията на мастната тъкан зависят тясно от редокс системата на GSH 26, 27, 28. Диференциацията на адипоцитите се насърчава от условия, които насърчават окисляването на вътреклетъчните отделения 29. По-специално, вариациите в съотношението на GSH към GSSG към окислителните условия придружават адипогенезата 28, 30, а изчерпването на GSH по време на диференциацията ускорява съзряването на белите адипоцити и увеличава натрупването на триглицериди 28. Интересното е, че всички състояния, за които се съобщава, че предотвратяват активирането на НДНТ и/или потъмняване на WAT (напр. Остри физически упражнения, излагане на студ, възпаление и рак), са сами по себе си стресови признаци, които са свързани с оксидативен стрес и биха могли да предизвикат забележителна промяна в редокс ниво на GSH. състояние на прооксидационните условия в плазмата и тъканите 14, 31, 32. Въпреки тези доказателства, ролята на GSH в модулирането на активността на НДНТ и покачването на WAT е напълно неизвестна.

В този доклад разгледахме възможността, че намаляването на концентрацията на GSH може да доведе до процес на потъмняване. Ние показахме, че нивата на GSH намаляват по време на покафеняване на мастните клетки и че лечението с нетоксичния инхибитор на синтеза на GSH бутионин сулфоксимин (BSO) предизвиква регулиране на несегрегирани дихателни гени (напр. Ucp1 и Ppargcla) в кафяви и бели адипоцити . Важното е, че също така установихме, че индукцията на редокс-чувствителния транскрипционен фактор Fox01 е от съществено значение за реакцията на покафеняване.

резултатът

Активирането на термогенна програма е свързано с намаляване на GSH

( A ) Ucp1 нивата на иРНК бяха измерени чрез RT-qPCR в eWAT и BAT при мишки, изложени на студ (4 ° С в продължение на 20 часа). Данните се отчитат като кратна индукция спрямо контролните мишки (21 ° C) и се изразяват като средно ± SD (n = 3 мишки на група; * p

( A ) Съдържанието на GSH беше измерено чрез HPLC в eWAT и BAT от третирани с BSO мишки (20 mM в питейна вода) в продължение на 5 седмици (ляв панел). Окислението на протеина се определя чрез тестване на карбонилни остатъци чрез Western blot анализ (десен панел). Актинът беше използван като контрол на натоварването. Следват денситометрични анализи на актин-нормализирани имунореактивни ленти. Оригиналните петна с пълна дължина са изброени в Приложение №. Фиг. S3. Данните се отчитат като nmol GSH/mg протеини и се изразяват като средна стойност ± SD (n = 4 мишки на група, * p

( A ) нивата на тРНК на Ppargcla, Ppara, Ucp1, Fgf21, Cidea и Dio2, измерени в мастната тъкан на третирани с BSO мишки за 24 часа (20 mM в питейна вода). Данните се отчитат като кратна индукция спрямо контрола и се изразяват като средна стойност ± SD (n = 4 мишки на група; * p 10-4 клетки) и се изразяват като средна стойност ± SD (n = 4; * p 3, 40. Интересно, студено монтираното термогенно устройство при мишки и изопротеренол в клетки 3T3-L1 също се характеризира с индукция на Fox01 (фиг. 4А, В) Предишно лечение с GSH естер, което показахме, че значително облекчава покафеняването на адипоцитите, беше в състояние да отбележи че намаляването на GSH чрез лечение с BSO е успяло ефективно да регулира нивата на Fox01 както в адипоцитите на WAT, така и в 3T3-L1, имитирайки наблюдаваното по време на лечението.

( A ) Нивата на Fox01 бяха открити от Western blots в eWAT и BAT при мишки, изложени на студ (4 ° C в продължение на 20 часа). Следват денситометрични анализи на актин-нормализирани имунореактивни ленти. Оригиналните петна с пълна дължина са изброени в Приложение №. Фиг. S5. Данните се отчитат като кратна промяна спрямо eWAT 21 ° C и се изразяват като средна стойност ± SD (n = 3 мишки на група, ** p 8, 9, 10, 11. Освен това такива условия генерират промени в редокс хомеостазата, което води до прооксидационни състояния 14, 31, 32. Реакциите, базирани на тиол, са силно включени в контрола на много клетъчни процеси, включително клетъчна диференциация 33, 34 .

Fox01 е редокс-чувствителен транскрипционен фактор, който нежно модулира липидния метаболизъм в мастните клетки 1. Индукцията на протеина Ucp139 също участва в ролята на Fox01 в метаболизма на мастната тъкан. Съответно, ние твърдим, че експресията на кафяво свързани гени като Ucp1 се модулира от BSO чрез FoxO1 пътя в белите адипоцити. Всъщност добавката на GSH естер ефективно ограничава активирането на Fox01 и експресията на гена Ucp1.

Като цяло нашите открития подчертават решаващата роля на редокс системата GSH в метаболитната адаптация на адипоцитите чрез повишено разсейване на енергията. Фаза I клинични проучвания с непрекъсната инфузия на BSO показват, че GSH може да бъде изчерпана без ненужна нормална тъканна токсичност 55, 56. Следователно, поради способността си да разсейва излишната енергия чрез митохондриално изключване в WAT и BAT, BSO може да се разглежда в бъдещи проучвания като лекарство със силен терапевтичен потенциал за лечение на метаболитни заболявания.

методи

Клетъчни линии, лечения и трансфекции

Мишки и лечения

Всички експерименти с мишки са извършени в съответствие с приетия стандарт за грижа за човешки животни и със съгласието на съответните национални комитети (Министерство на грижите) и местни комитети (Институционални грижи и употреба на животните, Университет Tor Vergata). Шестнадесет мъжки мишки C57BL/6 (на 1 месец) (закупени от Harlan Laboratories Srl, Урбино, Италия) бяха произволно разделени на 2 групи: нелекувани мишки (контролна група, n = 8 мишки) или третирани с BSO мишки (BSO, n = 8 мишки). Третираните с BSO мишки бяха разделени на случаен принцип в две подгрупи: мишки, третирани в продължение на 24 часа (n = 4 мишки) или мишки, третирани в продължение на 5 седмици (n = 4 мишки). BSO се доставя в питейна вода с крайна концентрация 20 mM. Шест мъжки мишки C57BL/6 (на възраст 6 седмици) бяха разделени на случаен принцип в две групи: група със стайна температура (контролна група, 21 ° C) или студена група (4 ° C). Излагането на студ се поддържа в продължение на 20 часа. Всички мишки бяха настанени в 12-часови цикли светлина/тъмнина и имаха свободен достъп до храна и вода. След изкълчване на шийката на матката тъканите бяха обяснени и незабавно обработени.

Изолиране на митохондрии

Получени са сурови митохондрии на мастната тъкан, както е описано в Wieckowski et al. 58. Пречистени митохондрии от 3T3-L1 и T37i са получени съгласно Kristian et al. 59 с някои модификации. Накратко, клетките се лизират при 4 ° С в хомогенизационен буфер (210 тМ манитол, 70 тМ захароза, 5 тМ HEPES, рН 7,4), допълнен с EGTA (Sigma-Aldrich), албумин 0,5% и инхибитори на протеаза и фосфатаза (Sigma- Aldrich)) и се центрофугира при 600 xg в продължение на 3 минути при 4 ° C, за да гранулира ядра и тежки частици. Супернатантът се събира и центрофугира при 17 000 х g в продължение на 17 минути при 4 ° С, за да гранулира митохондриите, които след това се промиват два пъти чрез центрофугиране при 17 000 х g за 15 минути при 4 ° С.

Определяне на протеиновото карбонилиране

Карбонилирани протеини бяха открити с помощта на Oxyblot Kit (Merck Millipore, Darmstadt, Германия), както е описано по-горе 3. Накратко, 15 μg протеини реагираха с 2,4-динитрофенилхидразин (DNP) в продължение на 15 минути при 25 ° C. Пробите бяха пуснати на 10% SDS-полиакриламидни гелове, а DNP-дериватизираните протеини бяха идентифицирани чрез Western blotting с помощта на anti-DNP антитяло и подходящо конюгирано пероксидазно хряново вторично антитяло.

Гел електрофореза и Western blot

Суровите митохондрии, клетъчните пелети, eWAT и BAT се лизират в RIPA буфер (50 mM Tris-HCl, рН 8,0, 150 mM NaCl, 12 mM дезоксихолова киселина, 0,5% Nonidet P-40 и протеазни и фосфатазни инхибитори). Бяха използвани протеинови проби за SDS-PAGE, последвано от Western blot. Нитроцелулозните мембрани бяха оцветени с първични анти-β-актинови антитела, Fox01 (Santa Cruz Biotechnologies), vDAC, Ucp1 (Abcam, Cambridge, UK), pHSL, PKA-Ser-субстрати (Cell Signaling Technologies, Danver, MA, USA), GSH. (Enzo Lifescience, Farmingdale, NY, САЩ) и 4-хидрокси-2-ноненал (4-HNE) хистидин (внимателно дарен от проф. Учида, Училище по биологични земеделски науки, Университет Нагоя, Япония), всички разредени мембрани 1: 1000. са инкубирани с подходящото конюгирано пероксидазно хряново вторично антитяло и имунореактивните ленти са открити с помощта на Fluorchem Imaging System след оцветяване с ECL-избран Western Blotting реагент за откриване (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA). Показаните на фигурите имуноблоти са представителни за поне три експеримента, които дават подобни резултати.

RT-qPCR анализ

Общата РНК беше извлечена с помощта на TRI Reagent® (Sigma-Aldrich). Три μg РНК бяха използвани за ретро-транскрипция с M-MLV (Promega, Madison, WI). qPCR се извършва в три екземпляра, като се използват валидирани праймери qPCR (BLAST), Ex TAq qPCR Premix и PCR LightCycler II в реално време (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), както е описано по-рано 40. MRNA нивата бяха нормализирани до mRNA на актин и относителните нива на mRNA бяха определени по метода 2-AAC .

Определяне на нивата на GSH

Вътреклетъчните GSH и GSSG бяха тествани след образуване на S-карбоксиметилни производни на свободни тиоли с йодоцетна киселина, последвано от превръщане на свободните аминогрупи в 2,4-динитрофенил производно чрез реакция с 1-флуоро-2,4-динитробензен, както е описано по-горе. 60 .

Митохондриален мембранен потенциал и тест за абсорбция на глюкоза

За да се оценят митохондриалните трансмембранни потенциални клетки, клетките се инкубират с Mitotracker Red (Life Technologies Ltd) при концентрация от 200 nM (30 минути, 37 ° С) преди цитофлуориметричен анализ. За измерване на усвояването на глюкоза, клетките се инкубират с флуоресцентен глюкозен аналог 2-NBDG (Life Technologies Ltd) при концентрация от 100 μM (30 минути, 37 ° С) преди цитофлуориметричен анализ.

имунохистохимия

Мастните тъкани бяха обяснени и незабавно фиксирани за една нощ във формалинов разтвор (Sigma-Aldrich), измити с вода, дехидратирани и вградени в парафин. Вградените в парафин тъкани се нарязват на 7 μm участъци и се оцветяват с хематоксилин и еозин (H&E) или Ucpl антитяло. Показаните изображения са представителни за един от четири експеримента, които дават подобни резултати. Размерът и броят на адипоцитите на площ са изчислени с помощта на ImageJ (Adipocytes Tool).

Консумация на кислород

Консумацията на кислород се определя в бели 3T3-L1 и кафяви T37i адипоцити, като се използва кислородна електродна система Oxygraph Plus (Hansatech Instruments Ltd, Norfolk, UK). В края на диференциацията клетките се третират с BSO в продължение на 24 часа, събират се и се суспендират отново с пълна хранителна среда в оксиграфска камера. Консумацията на кислород в реално време се записва при 28 ° С за 5 минути.

Статистически анализ

Резултатите са представени като средно ± SD Статистическа оценка е извършена от ANOVA, последвана от Student-Newman-Keuls. Разликите се считат за значими за P