абстрактно
Наскоро съобщихме, че биоразградимият поли [α- (4-аминобутил) -L-гликолова киселина] (PAGA) може да кондензира и защити плазмидната ДНК от DNase I. В това проучване изследвахме дали системното приложение на pCAGGS върху миши IL-10 (mIL -10) Експресионен плазмид, комплексиран с PAGA, може да намали развитието на инсулит при не-затлъстели мишки с диабет (NOD). Плазмените комплекси PAGA/mIL-10 бяха стабилни за повече от 60 минути, но голата ДНК беше унищожена в рамките на 10 минути от DNase I. PAGA/DNA комплекси бяха инжектирани в опашната вена на 3-седмични NOD мишки. Нивата на серумен mIL-10 достигнаха връх 5 дни след инжектирането и можеха да бъдат открити за повече от 9 седмици. Разпространението на тежкия инсулит при 12-седмични NOD мишки беше значително намалено чрез интравенозно инжектиране на PAGA/ДНК комплекс (15,7%) в сравнение с инжектиране на гола ДНК (34,5%) и нелекувани контроли (90,9%). В заключение, системното приложение на pCAGGS mIL-10 плазмид/PAGA комплекси може да намали тежестта на инсулита при NOD мишки. Това проучване показва, че PAGA/ДНК комплексът има потенциал да предотврати автоимунен захарен диабет.
Патологична характеристика на диабет тип 1 е клетъчно медиираното автоимунно разрушаване на β-клетките на панкреасните островчета (инсулит). Неотдавнашно проучване показа, че интрамускулното инжектиране на имуносупресивни цитокинови плазмиди може ефективно да потисне прогресията на автоимунния диабет при животински модел на диабет тип 1 (не затлъстяла диабетна мишка, NOD мишка).
Интравенозно приложение на голия плазмид се изразява в черния дроб, белия дроб и далака. Плазмидната ДНК обаче бързо се отстранява от кръвообращението поради широкото й чернодробно поемане и бързо разграждане от плазмената нуклеаза.456 Въпреки че е доказано, че сложното образуване, особено с катионни липозоми, повишава ДНК стабилността и генната експресия, плазмидът все още бързо се отстранява от плазмата. циркулацията и липозомните/плазмидни комплекси са токсични за клетките.78 Наскоро синтезирахме биоразградим катионен полимер, поли [α- (4-аминобутил) -L-гликолова киселина] (PAGA). Този полимер ефективно кондензира ДНК и е по-малко цитотоксичен от PLL. PAGA е биоразградим, нетоксичен за клетките и увеличава трансфекцията в култивирани клетки.9 Използвахме PAGA като ДНК носител за системно доставяне на миши IL-10 (mIL-10) и изследвахме дали тази полимерна система може да предотврати инсулит при NOD мишки . В това проучване установихме, че синтетичният PAGA повишава ефективността на трансфекция на плазмид pCAGGS mIL-10 in vitro. PAGA/mIL-10 плазмени комплекси могат да бъдат доставени в черния дроб след интравенозно инжектиране и комплексите могат да потиснат прогресията на автоимунния инсулит при NOD мишки.
резултатът
Формулиране in характеризиране in vitro
Проведено е проучване за забавяне на гела, за да се потвърди самостоятелното сглобяване на PAGA/плазмидни комплекси. Увеличаващи се съотношения на PAGA/плазмидни комплекси бяха идентифицирани чрез 1.0% агарозна гел електрофореза. Резултатите показаха, че PAGA е в състояние да кондензира плазмидна ДНК на малки частици в съотношение на заряд 2: 1 (+/-) (Фигура 1). Средният ефективен диаметър на PAGA комплексите (2: 1, +/-), определен чрез разсейване на светлината, е 179 nm. Стабилността в присъствието на DNase I е един от основните параметри на системно генетично доставяне. Резултатите от анализа на стабилността на DNase I са показани на Фигура 2. Всички голи ДНК са унищожени в рамките на 10 минути, но PAGA защитава ДНК от DNase I за повече от 60 минути.
Комплексът PAGA/ДНК се анализира чрез електрофореза за забавяне на агарозен гел. Линия 1, съотношение на зареждане PAGA/ДНК 2: 1 (+/−); лента 2, 1: 1; лента 3, 1: 2, лента 4, 1: 3; лента 5, голо ДНК. PAGA успя да улови ДНК в съотношение на зареждане 2: 1 (+/−).
Изображение в пълен размер
Разцепване на PAGA/ДНК комплекси чрез усвояване на DNase I. PAGA/ДНК комплексите се приготвят в съотношение 2: 1 (+/-) и се инкубират при 37 ° C. За да се отдели плазмидната ДНК от PAGA, се добавят 37 μl 1.0% SDS добавя се и комплексът се нагрява до 65 ° С за една нощ. ДНК се отделя върху 1.0% агарозен гел. а) гола ДНК; (b) PAGA/ДНК комплекс. PAGA успя да защити ДНК за повече от 60 минути.
Изображение в пълен размер
Ин витро трансфекция
Оценихме дали PAGA има засилен ефект върху доставянето на плазмид до 293T клетки (ATCC, Rockville, MD, USA). Ефективността на PAGA-медиирана трансфекция върху 293T клетки е значително по-висока от тази на гола ДНК (P
In vitro ефективност на трансфекция на PAGA/ДНК комплекс ДНК в 293T клетки (1 μg ДНК на гнездо, 2 х 104 клетки на гнездо). След 24 часа култивиране, средата за растеж се събира и нивото на mIL-10 се измерва с ELISA. Стойностите показват средно и стандартно отклонение.
Изображение в пълен размер
RT-PCR откриване на mIL-10 иРНК в черния дроб на NOD мишки
Определихме наличието на mIL-10 иРНК, транскрибирана от интравенозно инжектиран PAGA/ДНК комплекс чрез RT-PCR. За да се изключат RT-PCR продуктите от замърсен pCAGGS плазмид или ендогенна mIL-10 иРНК, праймерите са проектирани да включват интронната последователност на плазмида pCAGGS-mIL-10. Размерът на желания RT-PCR продукт е 222 базови двойки. В резултат на това mIL-10 тРНК беше открита в черния дроб след интравенозно инжектиране както в голите, така и в PAGA/ДНК комплексните групи (Фигура 4). Въпреки това, в черния дроб на голата група, експресията на плазмид mIL-10 намалява 5 седмици след инжектирането, докато групата PAGA/DNA комплекс показва подобна степен на експресия до 9 седмици след инжектирането. Продуктът RT-PCR на далака и панкреаса не е идентифициран.
RT-PCR на чернодробна тъкан на NOD мишки след интравенозни инжекции на PAGA/ДНК комплекси (144 μg PAGA/100 μg ДНК, 2: 1, +/-). Линии 1-5, група, инжектирана с PAGA/ДНК комплекс; линии 6-10, група, заредена с ДНК; лента М, молекулярен маркер; група С, PAGA инжектира групата. Линии 1 и 6, 1 седмица след инжектиране; платна 2 и 7, 2 седмици; платна 3 и 8: 3 седмици; платна 4 и 9, 5 седмици; платна 5 и 10, 9 седмици.
Изображение в пълен размер
In vivo експресия на mIL-10 и инсулит
Изследвахме дали инсулитът на NOD мишки може да бъде потиснат след интравенозни инжекции на плазмидния комплекс PAGA/mIL-10. Три седмични женски NOD мишки се инжектират веднъж със 100 μg плазмид mIL-10, комплексиран с PAGA (PAGA: съотношение на зареждане на ДНК = 2: 1, 200 μl, рН 7, 35 фосфатно буфериран физиологичен разтвор) във вената на опашката. По планирано време NOD мишки бяха жертвани, за да вземат кръвни проби и черен дроб. Миши серумни нива на IL-10 бяха измерени чрез ELISA 1, 2, 3, 5 и 9 седмици след системно приложение. Нивата на серумен mIL-10 NOD на мишки, инжектирани с PAGA/pCAGGS миши IL-10 плазмиден комплекс (група PAGA/ДНК комплекс) са значително увеличени и експресията на mIL-10 се поддържа над контролните нива за повече от 9 седмици (P
Концентрация на IL-10 в миши серум. Всяка NOD мишка получи интравенозно инжектиране на ДНК или PAGA/ДНК комплекси (2: 1, +/-, 100 μg ДНК на мишка) на 3-седмична възраст. Нивата на серумен mIL-10 бяха измерени чрез ELISA на 1, 2, 3, 5 и 9 седмици. На ден 0 не е изследвана група за инжектиране (контрола). Стойностите показват средна стойност ± sem
Изображение в пълен размер
Потискане на инсулит при NOD мишки след инжектиране на PAGA/ДНК комплекси (2/1, +/−) във вената на опашката в доза от 100 μg плазмид pCAGGS mIL-10 на мишка. Инсулитът се оценява чрез оцветяване с повече от 20 островчета от всеки панкреас с хематоксилин-еозин и оценка на прогресията на инсулита. а) група, инжектирана с PAGA; (б) група, инжектирана с PAGA/ДНК комплекс; (в) група, инжектирана с гола ДНК; (г) степен на инсулит 0; д) степен 2 инсулит; и (е) степен 4 инсулит.
Изображение в пълен размер
дискусия
Автоимунният захарен диабет е ясен кандидат за генна терапия. По принцип най-добрият начин за лечение на автоимунен диабет би бил да се идентифицират хората в риск и да се лекуват, за да се предотврати увреждането на островчетата.
При генната терапия основните пречки при лечението на заболявания са преходната експресия и ниската ефективност на трансфекция на плазмида. Многократните интравенозни инжекции могат да бъдат едно от решенията за преодоляване на тези основни бариери. По-ранни проучвания установиха, че нивата на експресия на интравенозно инжектирана гола ДНК са неоткриваеми.1011 Неотдавнашно проучване обаче показва, че нивата на експресия са високи за бързо интравенозно инжектиране на големи обеми гола ДНК.12 Интравенозното доставяне на гола ДНК остава предизвикателство. Защитата на плазмида от разграждане чрез нуклеаза може да доведе до по-висока ефективност на трансфекция
Успешното доставяне на ДНК от цитоплазмата до ядрото е важно за развитието на системите за генна терапия. Биоразградимите катионни полимери са въведени като система за доставяне на гени, която може да подобри ефективността на трансфекцията. Те могат да кондензират ДНК и да я предпазят от разграждане чрез нуклеаза. Висока и продължителна експресия на плазмид е постигната с биоразградим карнитинов естер след интравенозно приложение на мишки.
Друг вид синтезирана биоразградима генна система са катионните липиди. Катионните липиди индуцират по-висока трансгенна експресия в сравнение с други липозоми и тяхното разграждане в клетките увеличава ДНК без вътреклетъчни клетки.16 Установихме, че интравенозно инжектирани биоразградими PAGA/ДНК комплекси индуцират висока и дългосрочна експресия при NOD мишки. Този резултат предполага, че разграждането на PAGA може да увеличи ДНК без вътреклетъчни клетки. Все още е необходимо допълнително разследване.
Ендозомното освобождаване и дисоциация на катионния носител/ДНК комплекс преди транскрипцията е необходимо за подобряване на ефективността на трансфекция. Прекомерният положителен заряд може да бъде пречка за дисоциацията на катионния носител/ДНК комплекс.1718 Използвахме комплекса PAGA/ДНК в съотношение на заряд 2: 1 (+/−), което беше минимален, прекомерен положителен заряд.
Последните проучвания показват, че инфилтрацията на автореактивна мононуклеарна клетка в островчета (инсулит) се причинява от дисбаланс на цитокини, секретирани от помощни клетки от помощни клетки тип 1 (Th1) и тип 2 (Th2). 1920 Th1 клетъчно секретирани противовъзпалителни цитокини (IFN-γ и IL-2) повишават възпалителния и медииран от клетките имунитет, докато Th2-секретиращите противовъзпалителни цитокини (IL-4, 5, 6, 10 и 13) стимулират хуморалния имунитет . клетките медиират автоимунен инсулит. Активирането на Th1 клетки при NOD мишки беше потиснато от mIL-10, който може да предотврати инсулит и диабет.232425 Тази рекомбинантна цитокинова терапия показа ниска бионаличност, химическа нестабилност и модулиран имунен отговор. Превенцията на развитието на диабет при NOD с mIL-10 зависи от възрастта. Предишни данни показват, че се изисква инжектиране в млада възраст.1 Следователно ние инжектирахме PAGA/ДНК комплекса в 3-седмични NOD мишки, за да предотвратим инсулит. Плазмидът pCAGGS не причинява неспецифична индукция на нивата на IL-10.1
Накратко, биоразградимият катионен полимер PAGA може да кондензира pCAGGS миши IL-10 плазмид, да го защити от DNase I и да увеличи ефективността на трансфекция в 293T клетки. Системното приложение на pCAGGS mIL-10 плазмидни/PAGA комплекси може да намали тежестта на инсулита при NOD мишки. Тези резултати показват, че PAGA е отлично средство за трансфер на ген за интравенозно инжектиране на плазмид mIL-10.
Материали и методи
Синтез на PAGA
CBZ-L-оксилизин се синтезира от CBZ-L-лизин чрез диазотиране с натриев нитрит и сярна киселина, последвано от екстракция с етилов етер и след това се утаява с керосин. CBZ-L-оксилизинът се полимеризира чрез кондензация при 150 ° С под вакуум от 10 до 4 Torr за 5 дни. Охладеният полимер се разтваря в хлороформ и се утаява с метанол. Изсушеният полимер се разтваря с DMF, съдържащ паладий върху въглерод катализатор и 85% мравчена киселина се добавя като протонен донор. След 15 часа при стайна температура полимерният разтвор се изолира от катализатора чрез филтруване. Добавя се 2 N HCI и полимерът се утаява с ацетон. PAGA се съхранява при -70 ° C до употреба.
Три седмични женски NOD мишки са закупени от Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) и се поддържат при специфични условия, свободни от патогени. Мишките NOD бяха умъртвени по график чрез дислокация на шийката на матката след анестезия чрез вдишване на метоксифлуран (Schering-Plough Animal Health, Union, NJ, USA).
Получаване на плазмид pCAGGS mIL-10
Експресията на мишка на плазмидна ДНК на IL-10 pCAGGS се усилва в ефективността на субклониране DH5α на Escherichia coli (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) и пречистени Qiagen Plasmids Maxi Kits (Qiagen, Валенсия, Калифорния, САЩ). Чистотата и идентичността на плазмидния ДНК препарат се потвърждава чрез измерване на абсорбцията при 260 nm и 280 nm и чрез рестрикционна ензимна гел електрофореза на усвоените плазмиди.
Приготвяне на PAGA/ДНК комплекс
PAGA/ДНК комплексите бяха приготвени вътрешно. PAGA (1.5 mg) се разтваря в 1 ml физиологичен разтвор, буфериран с фосфат (PBS, рН 7, 3). Сто микролитра PAGA разтвор се добавят към 900 μl PBS. Десет микролитра от разредения разтвор на PAGA бавно се добавят на капки към 1 μl от приготвения ДНК ген плазмид (1,0 mg/ml) и се оставят за 30 минути (PAGA/ДНК зарядно съотношение 2: 1). Образуването на PAGA/ДНК комплекс е рутинно наблюдавано чрез електрофореза с 1.0% агарозен гел. 2627 Размерът на частиците на PAGA/ДНК комплекс е определен чрез динамично разсейване на светлината (BI-2030AT; Brookhaven Instruments, Holtsville, NY, USA).
Стабилност на PAGA/ДНК комплекси
Съотношението на зареждане (+/-) на PAGA: ДНК комплекса е 2.0 в PBS. След образуването на комплекс, DNase I (10 единици, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, САЩ) се добавя към комплексния разтвор и комплексната суспензия се инкубира при 37 ° С в продължение на 60 минути. Взема се 50 μl проба от комплексната суспензия на 0, 2, 5, 10, 20, 40 и 60 минути след инкубацията, смесва се със 75 μl стоп разтвор (4 М амониев ацетат, 20 mM EDTA и 2 mg/ml) . ml) и се поставя върху лед. За да се дисоциира плазмидна ДНК от PAGA, се добавят 37 μl 1.0% SDS и комплексът се нагрява при 65 ° С за една нощ. След екстракция с фенол и хлороформ, ДНК се утаява с етанол. Пелетите се разтварят в 10 μl TE буфер и се прилагат към 1,0% агарозна гел електрофореза.
Ин витро трансфекция
NIH 293T клетки (ATCC, Rockville, MD, USA) се култивират в 24-ямкови плаки (Corning, NY, USA) при концентрация 2 х 104 клетки на гнездо за 24 часа. Инициирани са култури в DMEM (Gibco-BRL), съдържащ 10% фетален говежди серум, допълнен със 100 U/ml пеницилин при 37 ° С за 24 часа с 5% CO 2. Растежната среда се отстранява и клетките се промиват с PBS. След добавяне на трансфекционна среда, 293Т клетки се инкубират в продължение на 24 часа, след това средата се събира и съхранява при -70 ° С, докато се използва за mIL-10 експресионния тест.
Реакция на полимеразна обратна транскрипция (RT-PCR)
Обща РНК беше изолирана от черния дроб на мишка NOD в планирани часове, използвайки система за микроизолиране на въртящи се касети GlassMAX RNA (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA). Обратната транскрипция се извършва при 37 ° С в продължение на 1 час, като се използва обратна транскриптаза (Qiagen) и обратен праймер. Специфичните олигонуклеотидни праймери са 5'-GCTGGTTATTGTGCTGTCTC-3 'праймер, 5'-CTCTAGGAGCATGTGGCTCT-3' обратен праймер. Тези праймери са проектирани да включват интронна последователност, за да могат да се разграничат всички възможни PCR продукти от замърсяване с плазмидна ДНК или геномна ДНК.1 Използва се следният PCR реакционен цикъл: 40 цикъла при 94 ° C за 1 минута, 60 ° C за 1 min и 72 ° C 1 min 30, последвано от удължаване от 10 min при 72 ° C. Дължината на очакваните продукти е 222 базови двойки. PCR продуктите се анализират чрез електрофореза върху 1,0% агарозни гелове, визуализирани чрез оцветяване с етидиев бромид под UV светлина.
Анализ на мишки IL-10 и измерване на инсулит при NOD мишки
Статистически анализ
Сравнението на концентрацията на IL-10 се извършва чрез t тест на Student. Стойността на Р под 0,05 се счита за статистически значима.
Благодаря
Авторите благодарят на Expression Genetics Inc. за финансовата им подкрепа и Jun-Ichi Miyazaki от университета в Осака в Япония за щедрото им дарение на плазмид pCAGGS mIL-10. Бихме искали да благодарим на Трой Кох за техническа помощ.