Резюме

Предсърдният натриуретичен пептид (ANP) е важен компонент на натриуретичната пептидна система. Мастните клетки играят основна роля в много регулаторни системи. Междувременно участието на тези клетки в активността на ANP е недостатъчно проучено. В тази работа ние демонстрирахме присъствието на ANP в перитонеалните мастоцити на плъхове. Чистата фракция на мастоцитите е получена чрез разделяне на перитонеални клетки на плъх върху градиент на плътност на Percoll. Два ANP-имунореактивни протеина с молекулно тегло от 2.5 kDa и 16.9 kDa бяха открити в лизати от тези мастоцити чрез Western blotting. Електронното микроскопско имунозлатно маркиране разкрива присъствието на ANP-имунореактивен материал при съхранението, секрецията и освобождаването на гранули от мастоцити. Нашите открития показват, че перитонеалните мастоцити на плъхове съдържат както ANH прохормон, така и ANP. И двата пептида са разположени в гранули на секреторни клетки на мастоцити и се освобождават чрез механизъм за дегранулация. Обсъжда се, че много функции на мастоцитите могат да се дължат на производството на натриуретични пептиди от тези клетки.

Предсърдният натриуретичен пептид (ANP) е хормон с диуретични, натриуретични и съдоразширяващи свойства. Този пептид се произвежда главно от предсърдни кардиомиоцити 1. Секрецията на ANP от кардиомиоцитите се индикира от наличието на специфични секреторни везикули, така наречените предсърдни гранули, в тези клетки. Съдържанието на предсърдните гранули се освобождава поради претоварване, липса на кислород и много други физиологични и патологични процеси в миокарда. ANP се произвежда и от овчи фибробласти, инфилтриращи миокарден инфаркт 2, клетки на проводима система на плъхове и говеда, 4 мозъчни неврони на плъхове 5, тимусни клетки на плъхове 6, клетки на роговицата на говедата 7, гладкомускулни клетки на плъхове 8 и макрофаги на мишки 9. .

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Изолация на мастоцитите

Фракцията на чистите мастоцити се изолира от суспензия на перитонеална клетка на плъх чрез разделяне на клетките на градиент на плътност на Percoll, както е описано в подробен протокол 14. Използвани са шест възрастни плъха Wistar с тегло 250-300 g. След етерна анестезия и обезглавяване, 10 ml PBS се инжектират в перитонеалната кухина на животното; по време на нежен коремен масаж, перитонеалната кухина се отваря и клетъчната промивка се събира с помощта на пастьорска пипета. Промивки от 6 плъха се центрофугират при 120 х g за 10 минути, пелетите се суспендират отново в 0,5 ml PBS и получената клетъчна суспензия се наслоява на 88% Percoll градиент. Градиентът на Percoll се получава чрез добавяне на 0.7 ml 10-кратно концентриран RPMI (Gibco BRL) към 200 mM Hepes/1M NaOH, рН 7.0 и центрофугиране при 17 000 х g в продължение на 20 минути. Полученият градиент на Percoll с клетъчна суспензия, наслоена отгоре, се центрофугира при 450 х g за 15 минути. Фракцията на мастоцитите, която сега заема дъното на епруветката, се събира и промива два пъти в PBS. Проби за електронна микроскопия от клетъчната суспензия са взети преди (проба 1) и след разделяне (проба 2) в Percoll. Изолирани клетки бяха изследвани чрез Western blot анализ и електронна микроскопия имуноцитохимия.

Western blot анализ

Пречистените мастоцити се лизират в буферен разтвор със следния състав (mM): 10 x Tris-HCl, pH 7, 4, 150 NaCl, 0,5% Nonidet-P40, 0,2 апротинин, 0,2 леупептин, 1 Na-ортованадат, натрий 1 -флуорид. 0,2 фенилметилсулфонил флуорид и 20% глицерол. Лизатните протеини се разделят чрез 20% SDS полиакриламиден гел електрофореза 15 и се прехвърлят в нитроцелулозна мембрана 16. Откриването на ANP-имунореактивни протеини се извършва с първично поликлонално заешко антитяло синтетичен С-краен ANP (аминокиселини 99-126, Peninsula Lab. Inc., Bachem), разредено 1: 1000, и вторично антитяло от хрян, конюгирано с пероксидаза от хрян върху миши IgG (Сигма). Протеини върху имуноблоти бяха открити чрез метод на повишена хемилуминесценция. Търговски ANP плъх (Sigma) служи като контрола. За калибриране е използван комплект за молекулни тегла от 2,5 до 17 kDa (Sigma).

Електронен микроскоп имуноцитохимия

Използвани са следните антитела: същото първично антитяло като за Western blotting, разредено 1: 1000 и конюгиран със злато (10 nm) протеин A (Sigma), разреден 1:20 като вторично антитяло.

Клетките бяха фиксирани с 2.5% глутаралдехид в 0.1 М натриев какодилатен буфер, рН 7.4, за 1 час, фиксирани с 1% OsO 4, оцветени в блок с уранил ацетат, дехидратирани и поставени в Epon-Araldit съгласно стандартната процедура. Ултратънките секции бяха изрязани с диамантен нож и монтирани върху никелови решетки. Решетъчните решетки се обработват в Н202 и след това се инкубират за една нощ при 4 ° С с първичното антитяло, последвано от инкубация в продължение на 1 час при стайна температура с вторичното антитяло. Препаратите се оцветяват с уранилацетат и оловен цитрат и се изследват под електронен микроскоп JEM 7A при 80 kV. Специфичността на имунооцветяването се оценява със следния контрол: чрез пропускане на първичната антисерумна стъпка и прилагане само на вторичното антитяло. Контролът даде отрицателни резултати, т.е. незначителни случайни отлагания на златни частици върху участъците. Делът на мастоцитите в проби 1 и 2 се изчислява с помощта на светлинен микроскоп върху поленови участъци, оцветени с метиленово синьо. 300 клетки бяха анализирани за всяка проба.

РЕЗУЛТАТИТЕ

перитонеални

Мастоцитите (стрелките), наред с други клетки, обитават перитонеалната кухина на плъха (проба 1 преди фракциониране в Percoll). Семитинова част, оцветена с метиленово синьо. Лента = 5 um.

Изображение в пълен размер

Мастоцити след изолиране в Percoll (проба 2). Семитинова секция, оцветена с метиленово синьо. Пръчка = 5 μm.

Изображение в пълен размер

Електронна микрофотография на мастоцит в състояние на дегранулация. В клетката, между гранули за съхранение с хомогенен материал, се наблюдават изхвърлящи гранули с дезорганизирана матрица и освободени гранули (r) близо до клетъчната повърхност. N, ядро. Пръчка = 1 μm.

Изображение в пълен размер

Western blot анализ

Идентифицирането на ANP-имунореактивни протеини в перитонеалния лизат на мастоцитите (Фиг. 4) показва наличието на два протеина, разпознати от антитялото в С-крайната част на ANP. Тези протеини имат молекулно тегло приблизително 2,5 kDa и 16,9 kDa. Позицията на протеина с по-ниско тегло съответства на ANP позицията на контролния плъх.

Уестърн блотинг на перитонеални мастоцити на плъхове (линия А) и синтетичен ANP пептид на плъх (линия В) реагира с антитела срещу С-крайни ANP на плъхове (99-126) след разделяне на SDS чрез електрофореза в полиакриламиден гел. Две ленти - 2,5 kDa и 16,9 kDa показват наличието на зрял ANP и proANP.

Изображение в пълен размер

Електронен микроскоп имуноцитохимия

Вътреклетъчната локализация на ANP-имунореактивен материал беше демонстрирана на ниво електронен микроскоп чрез имунозлатно маркиране. Установено е, че имунооцветяването е ограничено до секреторни гранули на мастоцити както от първата, така и от втората проба. Показано е съхранението (фиг. 5) и екскрецията (фиг. 6) на гранулите, както и гранулите, разположени близо до повърхността на мастоцитите (фиг. 7). Не е показана локализация на имунозлатни частици над цитозола или органели от мастоцити, различни от гранулите. Еозинофилните гранули също са слабо имунореактивни в ултратънките части на клетките от първата проба (фиг. 8). Централната част на еозинофилните гранули беше заета от кристалоидни електрони с плътни структури. Маркът беше поставен еднакво върху всички компоненти на гранулите. Не се наблюдава отговор в други клетки. Контролните препарати (без първично лечение с антитела) показват отрицателен резултат.

Имуноелектронна микрография, показваща наличието на ANP-имунореактивен материал в гранули за съхранение на мастоцити. Същите златни частици са маркирани със стрелки. Пръчка = 0,2 μm.

Изображение в пълен размер

ANP-положително имунооцветяване в секретираните гранули от мастоцити. Същите златни частици са маркирани със стрелки. Пръчка = 0,2 μm.

Изображение в пълен размер

Етикетиране на ANP в освободени гранули от мастоцити. Същите златни частици са маркирани със стрелки. Пръчка = 0,2 μm.

Изображение в пълен размер

Еозинофилни гранули слабо имуномаркирани за ANP. Стрелките показват златни частици, отложени върху гранулите. Пръчка = 0,5 μm.

Изображение в пълен размер

ДИСКУСИЯ

След фракциониране в градиент на Percoll, клетъчната суспензия е съставена от 98% мастоцити. Чистотата на тази популация е гаранция, че ANP-имунореактивният материал, открит от Western blot, произхожда от мастоцити. Известно е, че ANP е предшественик с високо молекулно тегло, проатриален натриуретичен пептид (proANP), съставен от 126 аминокиселинни остатъка. С-терминалният фрагмент на тази молекула представлява зрялата форма на ANP (99-126), която е резултат от разцепване на прохормона (вж. Проучване 17). Незасегнатият proANP обаче също се освобождава в кръвта и циркулира със зрял ANP18. Наличието на proANP (1-126, 16, 9 kDa), но не на зрял ANP (99-126, 2, 5 kDa) е показано в екстракти от предсърдна тъкан на плъх 3. Установихме наличието на два ANP-имунореактивни протеина в перитонеалните мастоцити на плъхове. Единият имаше същото молекулно тегло като зрелия ANP-2.5 kDa, докато другият протеин имаше молекулно тегло 16.9 kDa, което съответства на теглото на proANP с пълна дължина. По този начин нашите данни показват, че перитонеалните мастоцити на плъхове съдържат както зрял ANP, така и неговия предшественик.

Имуноцитохимията с електронен микроскоп показа, че ANP-имунореактивният материал присъства в гранули от мастоцити. Наличието на маркиран материал в гранулите за съхранение, екскреция и освобождаване показва, че секрецията на ANP от мастоцитите се осъществява по класическия механизъм на дегранулация.

Широкото разпространение на мастоцитите в тялото може да причини откриването на ANP в почти всички гръбначни тъкани 19. Много биологични функции на мастоцитите, като имунорегулаторен потенциал 20, противотуморен ефект 21 и други, може да се дължат на тяхното генериране на ANP.

Важна особеност на мастоцитите е способността им да произвеждат предаватели, които имат противоположни ефекти върху същия процес. Например мастоцитите произвеждат както хистамин, който има противовъзпалителен ефект, така и хепарин, който има противовъзпалителен ефект. Наскоро бе доказано, че мастоцитите на сърцето на плъх и HMC-1 клетките (човешка мастоцитна линия) съдържат ренин, активатор на ренин-ангиотензин-алдостероновата система 22 и естествен ANP антагонист 23, 24. За разлика от диуретичния ANP, ренинът има антидиуретичен ефект. Изразява се мнението, че сърдечно-съдовата хомеостаза се поддържа чрез баланс между натриуретичната пептидна система и ренин-ангиотензин-алдостероновата система 25. По този начин, секретирайки определени количества ренин и/или ANP, мастоцитите могат ефективно да регулират този баланс.

Перитонеалните мастоцити играят важна роля в коремните патологични процеси. Следователно те изпълняват защитна функция в патогенезата на септичния перитонит 26. Доказано е също, че коремната хирургия предизвиква дегранулация на мастоцитите и увеличава факторите, получени от мастоцитите в перитонеалната течност 27. Наличието на ANP, открито в перитонеалните мастоцити, може, от една страна, да обясни много известни функции на тези клетки и, от друга страна, да предскаже някои от все още неизследваните им биологични ефекти, разширяващи функционалния обхват на мастоцитите. Установено е, че перитонеалните мастоцити на плъхове освобождават хистамин (провъзпалителен фактор) в отговор на ефекта на ANP 28, 29. Може да се предположи, че по време на интраперитонеално възпаление този процес протича по автокринен начин поради освобождаването на ANP от активирани мастоцити. Интересното е, че ANP също намалява секрецията на възпалителни медиатори в макрофаги и следователно има противовъзпалителен потенциал 30. Тези данни отново показват функционалния дуализъм на мастоцитите. Поради своите биологични ефекти, ANP, получен от мастоцити, може да бъде от голямо значение за регулиране на физиологичното състояние на коремните органи. Например, се съобщава, че ANP влияе върху функцията на яйчниците при мишки 31 .

Наличието на ANP-имунореактивен материал в еозинофилните гранули, което беше разкрито в нашата работа, може да се дължи на производството на този пептид от тези еозинофили и/или тяхната абсорбция на ANP, освободен от други клетки, вероятно мастоцити. Последното предложение се потвърждава от данни, показващи, че еозинофилите са способни да абсорбират освободените продукти от гранули на мастоцити 32 .

Благодаря

Много сме благодарни на д-р Leonid Z PEVZNER за коригиране на английския текст. Тази работа е частично подкрепена от Руската фондация за фундаментални изследвания (грант 05-04-49393).