елементи

абстрактно

Основното

Хондрогенните прогениторни клетки (CPC), като хрущялните семенни клетки, са важни за поддържането на хомеостазата на хрущяла. 1, 2 CPCs бяха идентифицирани за първи път в телешкия хрущял като субпопулация на клетки от повърхностната зона, за която се установи, че е необходима за апозиционен растеж в ставния хрущял. 3 Koelling et al. 1 също установи CPC в ставния хрущял по време на по-късните стадии на човешки остеоартрит (ОА). Тези клетки-предшественици мигрират към местните места на нараняване, където се размножават и диференцират, ако е необходимо, за да заместят увредената тъкан. 2 Мезенхималните стволови клетки-предшественици се разширяват значително и могат да се диференцират в множество линии, включително кости, хрущяли, сухожилия, мускули и нервни клетки, при специфични условия на in vitro култура. Намалената функция на мускулните стволови клетки се предполага като потенциална основна причина за намалената способност на застаряващите бозайници да поддържат скелетната мускулна тъкан. 4 Същият ефект се наблюдава и в хрущялната тъкан. Следователно инхибирането на CPC функцията може да бъде рисков фактор за ОА.

Установихме, че възпалителните медиатори на ОА, открити в синовиалната течност, предизвикват дегенерация на нормален ставния хрущял, когато се инжектират в непокътнатите кухини на ставите на кучета бигъл. Сред тези възпалителни цитокини лептинът е от особен интерес, тъй като засяга хомеостазата на телесното тегло и значителната и положителна корелация между лептина и дегенерацията на хрущяла. Лептинът, който се произвежда от бяла мастна тъкан, е малък (16 kDa), негликозилиран протеин, кодиран от гена Ob. Лептинът и неговият рецептор са изолирани от човешки хондроцити, остеофити, синове и подложки за вливане на мазнини. 9, 10

Stannus OP et al. предостави доказателства, демонстриращи, че нивата на серумния лептин са независимо и последователно свързани с намалена дебелина на хрущяла, както в напречно сечение, така и в надлъжно, което предполага, че лептинът играе важна роля в етиологията и развитието на ОА. 8 Simopoulou et al. 11 също така установи, че експресията на лептин и лептинов рецептор (Ob-Rb) е значително по-висока в хрущяла на пациенти с напреднал ОА, отколкото в хрущяла на пациенти с лека ОА. В допълнение, протеогликаните в ставния хрущял се изчерпват, когато лептин се инжектира в колянните стави на плъхове. Предишни проучвания са изследвали ефектите на лептина върху биологичните функции на хондроцитите. Въпреки това, механизмите, които медиират индуцирана от лептин дегенерация на хрущяла, не са точно определени. Изследването на ефектите на лептина върху биологичните функции на CPC би увеличило нашето разбиране за ролите, които лептинът играе в разграждането на хрущяла.

Тук изолирахме и идентифицирахме CPC от хрущяла на коленете на плъхове. Лептинът променя диференциацията на CPC чрез инхибиране на хондрогенезата и увеличаване на остеогенезата. Лептинът също индуцира стареене в CPC чрез активиране на пътя p53/p21 и инхибиране на пътя Sirt1. Активирането на лептиновия път (по-високи нива на Ob-Rb) е в значителна корелация с дегенерацията на хрущяла (по-ниски нива на Coll-2) и стареенето на тъканите (по-високи нива на p53/p21 и по-ниски нива на Sirt1) при OA. Заедно нашите резултати разкриват нови връзки между затлъстяването и увреждането на хрущяла, които са причинени от медиирани от лептин ефекти върху поведението на клетките, стареенето и вътреклетъчната сигнализация.

резултатът

Идентифициране на CPC, изолирани от хрущяла

лептинът

Изображение в пълен размер

Високите дози лептин намаляват миграционните способности, инхибират хондрогенния потенциал и увеличават остеогенния потенциал на CPC.

Изображение в пълен размер

Лептинът повишава нивата на p53, ацетилирани p53, p21 и Sirt1 по време на стареене на CPC

Два основни пътя водят до индуциране на клетъчно стареене: p38 митоген-активирана протеин киназа (MAPK)/p16 INK4a пътища и p53/p21 cip пътища. Нивата на фосфорилиран p38 MAPK в CPC са малко по-високи в клетките, отглеждани в присъствието на физиологични и високи дози лептин, отколкото в контролните клетки. Въпреки това, нивата на p53, ацетилирани p53 и p21 са значително по-високи в клетките, третирани с високи дози лептин, отколкото в контролната група. По-ниските нива на деацетилаза на пръста Sirt1 често са свързани с медиирано от p53 стареене. Експресията на Sirt1 е значително по-ниска в клетките, третирани с високи дози лептин, отколкото в контролните клетки, а нивата на ацетилиран р53 също са по-високи в тези клетки. Лептинът може да предизвика CPC стареене чрез активиране на p53/p21 пътя и инхибиране на Sirt1.

Лептинът индуцира стареене в CPC чрез активиране на p53/p21 пътя

Извършихме поредица от тестове за инхибиране на пътя, за да проучим допълнително ролята на p53/p21 пътя в стареенето на CPC. CPCs бяха третирани с висока доза лептин и или р38 инхибитор SB203580, или р53 инхибитор PFT-α, и ефектите от тяхното инхибиране бяха анализирани (Фигура 4а). Клетъчното стареене се оценява чрез определяне на процента на SA-β-Gal-положителни клетки. Инхибиторът p38 SB203580 няма видим ефект върху процента на SA-P-Gal-положителни клетки, но клетките, третирани с p53-PFT-α инхибитор, показват значително по-нисък процент на SA-P-Gal-оцветени клетки (Фигури 4b) . и в). Както p53, така и P-p38 инхибиторите не успяват да увеличат процента на стареещите клетки. Тези резултати показват, че лептинът индуцира стареене в CPC чрез активиране на p53/p21 пътя.

Блокадата на пътя p53/p21 инхибира стареенето в лекуваните с лептин CPC. ( а ) P38 инхибиторът SB203580 (10 μM) значително намалява експресията на P-p38. Инхибиторът p53-PFT-α (20 μM) значително намалява експресията на p21. ( б а ° С ) Процентът на SA-β-Gal-положителни клетки беше значително намален, след като клетките бяха третирани с PFT-α и 100 ng/ml лептин, но не и след като клетките бяха третирани със SB203580 и 100 ng/ml лептин в продължение на 48 часа. представляват средната стойност ± SD скала, 100 μm. * P # P> 0,05 означава, че резултатите не са статистически значими

Изображение в пълен размер

Индукция на CPC стареене от лептин чрез инхибиране на пътя Sirt1 21/p53

За да потвърдим, че пътят Sirt1 е включен в индуцирания от CPC лептин-индуцирано стареене, ние изследвахме ефекта от активирането и блокирането на Sirt1. Установихме, че когато клетките се третират с висока доза лептин (100 ng/ml) и ресвератрол (30 μM), активатор на Sirt1, експресията на ацетил p53 е по-ниска, отколкото в контролните клетки и че процентът на SA-β-Gal -положителните клетки са намалели до 25% (Фигури 5b и c). Този резултат показва, че активирането на Sirt1 предотвратява индуцираното от лептин стареене в CPC и че лептинът индуцира стареене чрез инхибиране на пътя Sirt1. За да определим дали индуцираното от лептин инхибиране на Sirt1 насърчава стареенето в хрущялните тъкани, подготвихме ставната хрущялна тъкан от коленете на тримесечни мишки Sirt1 KO (Sirt1 -/-) (един месец след нокаут), за да изследваме ефекта на Sirt1 KO на p53 и p21 израз. Мишките Sirt1 -/- показаха значително по-високи нива на p53/p21, отколкото техните естествени носилки в хрущялните тъканни секции (Фигури 5д и f). Тези резултати потвърждават, че лептинът индуцира стареене в CPC чрез инхибиране на пътя Sirt1 и активиране на пътя p53/p21, което може да наруши поддържането на хомеостазата на хрущялната тъкан и да доведе до стареене на хрущяла.

Активирането и блокирането на Sirt1 е повлияло на стареенето на CPC чрез индуцирания от лептин p53/p21 път. ( а а б ) Клетките се третират с ресвератрол и лептин и се анализира процентът на SA-β-Gal-положителни клетки. Култивираните CPC се третират с ресвератрол (30 μM), агонист на пътя Sirt1 и 100 ng/ml лептин. ( ° С ) След 48 часа лечение, Western blot анализ показа, че експресията на ацетилиран р53 е инхибирана. ( д ) PCR анализ на геномния локус Sirt1 при хетерозиготни флоксирани мишки със и без тамоксифен. ( д а е ) Сравнение на броя на p53 и p21 положителни клетки при мишки от див тип и KO. Изображенията от флуоресцентна микроскопия показват, че пътят p53/p21 е бил по-активиран в ставните хрущялни тъкани на мишките Sirt1 KO, отколкото при мишки от див тип. Скала, 100 μm. Лентите за грешки показват средната стойност ± SD * P

Използвахме специфичен маркер, CD146, за да обозначим CPC, 14, 21 и установихме, че прогениторните клетки са разпределени главно в повърхностния слой (Фигура 1в). Този резултат е в съответствие с констатациите от предишни проучвания. Тези резултати предполагат, че CPC могат да присъстват в матрикса на ставния хрущял, освен ако не се активират от определени състояния, като травма и възпаление, които изискват възстановяване на увредените хрущялни тъкани. 5

В допълнение, нашите проучвания показаха, че високите дози лептин инхибират пролиферацията (Фигури 3а и b) и предизвикват спиране на клетъчния цикъл в CPC. Спирането на клетъчния цикъл обикновено води до почивка или стареене. 19 Покойът е обратим процес, който води до преходно състояние на клетъчен покой. И обратно, стареенето води до необратима промяна в нормалните клетъчни дейности. Клетъчното стареене се наблюдава за първи път в старите клетки, но може да се появи и в младите клетки. Стареещите клетки продължават да растат и изглеждат по-големи от несенесцентните си колеги. Хипертрофията, свързана със стареенето, води до увеличаване на броя и активността на лизозомите, характеристика, използвана в един от най-широко използваните анализи за идентифициране на стареенето, SA-β-Gal, който се основава на лизозомната активност на β-галактозидазата. 15, 28

Наблюдавахме увеличаване на процента на SA-β-Gal-положителни CPC, когато клетките бяха отгледани в присъствието на високи дози лептин in vitro (Фигури 3в и d). Тези данни показват, че лептинът предизвиква стареене в CPC. Два основни пътя водят до индуциране на клетъчно стареене: p38 митоген-активирана протеин киназа (MAPK)/p16 INK4a пътища и p53/p21 cip пътища. Ние показваме, че нивата на p53, ацетилирани p53 и p21 са значително по-високи при лекуваните с лептин CPC, отколкото при контролните CPC (Фигури 3д и f). Активирането на p53 може да доведе или до насърчаване на апоптозата, или до индукция на стареене. Чипът p21 е контролер за клетъчен цикъл, който е от решаващо значение за определяне на резултата от активирането на p53, тъй като предизвиква спиране на клетъчния цикъл, инхибира p53 проапоптотичната активност и канализира p53 активността, за да предизвика стареене. След блокиране на p53/p21 пътя, процентът на SA-β-Gal-положителни клетки е значително по-нисък при лекуваните с лептин + PFT-a CPC. За разлика от това, няма видима промяна в процента на SA-P-Gal-положителни клетки в клетки, третирани с лептин + P-p38 инхибитор, въпреки че нивата на P-p38 са по-ниски в тези клетки, отколкото в CPC, лекувани само с лептин. (Фигури 4б и в). Тези резултати показват, че лептинът активира p53/p21 пътя, за да предизвика CPC стареене.

Sirt1 често се свързва с медиирано от p53 стареене, тъй като намалява нивата на p53 деацетилаза и стабилизира p53, 30, което има вредни ефекти, които намаляват функцията на p53. Активирането на Sirt1 с помощта на ресвератрол показа, че сигнализирането на Sirt1 участва в индуцираното от лептин стареене в CPC (Фигури 5b и c). Също така открихме, че участъци от ставната хрущялна тъкан, получени от мишки Sirt1 KO до 3-месечна възраст, показват по-високи нива на p53 и p21, отколкото са били изразени в сравними разрези, получени от WT мишки (Фигури 5е и f). Инхибирането на пътя Sirt1 и активирането на пътя p53/p21 изглежда имат синергичен ефект върху стареенето в CPC, което включва дегенерация на хрущяла и OA.

Загубата на нормална функция в резултат на индуцирането на стареенето е свързана с възрастови заболявания и дегенерация на тъканите. 31, 32, 33 Сравнявайки хрущялните тъкани, събрани от една и съща коленна става на ОА, които показват различни нива на дегенерация, установихме, че нивото на лептин е хомогенно и че ефектът на лептина е променлив. Наблюдавахме по-тежка дегенерация в хрущялните тъкани (ниска експресия на Coll-2) с по-висока експресия на Ob-Rb (която активира лептиновия път), по-висока експресия на p53/p21 (която предизвиква стареене на тъканите) и по-ниска експресия на Sirt1 в същата колянна става ( Фигури 6а аб). Нашите данни подкрепят съществуването на връзка между Ob-Rb и Coll-2, пътя p53/p21 и пътя Sirt1 (Фигури 6d-f) и идеята, че индуцираното от лептин стареене се индуцира в CPC чрез активиране на p53. p21 път и инхибиране на пътя Sirt1. Ние също така показваме, че тези процеси могат да бъдат по-зависими от функцията на Ob-Rb при пациенти с ОА и може да имат важен принос за ОА. Тези резултати също обясняват защо се наблюдава повече разреждане в медиалния тибиален хрущял по време на дегенерация на хрущяла 8, което е придружено от увеличаване на експресията на Ob-Rb (Фигура 6а).

ИТМ или процентът на телесните мазнини показва относително увеличение при някои хора с увеличаване на възрастта, а нивата на лептин също изглежда са склонни да се увеличават с възрастта. Нашите резултати показват, че повишените нива на лептин могат да имат пагубен ефект върху CPC функцията и да ускорят дегенерацията на хрущяла. Контролът на теглото може да бъде важно средство за предотвратяване на ОА. Независимо от това дали индуцираното от лептин стареене при CPC и дегенерация на хрущяла може да бъде нарушено и дали по-високи нива на експресия на Ob-Rb, наблюдавани при тежка дегенерация на хрущяла, са предизвикани от биомеханични сили, ще изискват допълнителни проучвания.

заключения

Накратко, лептинът променя съдбата на диференцираните CPC чрез инхибиране на хондрогенезата и увеличаване на остеогенезата. Лептинът предизвиква стареене в CPC чрез активиране на пътя p53/p21 и инхибиране на пътя Sirt1. Активирането на лептиновия път (по-висока експресия на Ob-Rb) е в значителна корелация с дегенерацията на хрущяла (по-ниски нива Coll-2) и стареенето на тъканите (по-високи нива p53/p21 и по-ниски нива Sirt1) при пациенти с ОА, което предполага, че индуцираният от лептин CPC ценности стареене допринася за развитието на ОА. Като цяло нашите резултати показват нови връзки между затлъстяването и увреждането на хрущяла, които включват медиирани от лептин ефекти върху диференциацията и стареенето на CPC.