генома

  • елементи
  • абстрактно
  • Основното
  • резултатът
  • Сглобяване на генома
  • Анотация на генома
  • Еволюционен анализ
  • Потенциален механизъм за определяне на пола
  • Транскрипционен анализ на прехода към хранителни навици
  • дискусия
  • методи
  • Подготовка и секвениране на ДНК библиотека.
  • Сглобяване на последователност.
  • Предсказване на протеини, кодиращи гени.
  • Пренаписване на последователности.
  • Идентифициране на мъжки контиги, разположени на потенциална полова хромозома.
  • Подготовка на проби и идентифициране на диференциално експресирани гени в експерименти с FHT.
  • URL.
  • Кодове за достъп.
  • История на промените
  • стъпки
  • Основни присъединения
  • Биопроект
  • Архив на последователността на последователностите
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителен текст и изображения
  • Excel файлове
  • Допълнителна таблица 16
  • Допълнителна таблица 17
  • Допълнителна таблица 18
  • Допълнителен набор от данни

елементи

  • ДНК секвениране
  • Погрешността на тази статия е публикувана на 29 юли 2015 г.

Тази статия е актуализирана

абстрактно

Тревният шаран е важна риба, отглеждана в стопанства, представляваща ∼ 16% от свежоводните аквакултури и има вегетарианска диета. Тук представяме концепцията за генома от 0,9 Gb на гиногенетична възрастна жена и генома от 1,07 Gb на див див възрастен мъж. Геномната анотация идентифицира 27 263 генни модела, кодиращи протеини в женския геном. Общо 114 скелета, състоящи се от 573 Mb, са закотвени в 24 групи за свързване. Смята се, че разликите между амур и зебра са се появили преди 49 до 54 милиона години. Ние идентифицираме сливането на хромозоми при шараните по отношение на зебрата и регистрираме чести преходи между хромозомите на X и Y шаран. Установихме, че транскрипционното активиране на пътя на мевалоната и биосинтезата на стероиди в черния дроб е свързано с адаптацията на амур от месоядни към растителноядни диети. Ние вярваме, че геномът на шаранската трева може да служи като начална платформа за отглеждане на по-качествени риби, използвайки геномен подход.

Основното

а ) Снимка на възрастен шаран. б ) Честотно разпределение 55 метра. Разпределението на K -mer честотата в показанията е получено от библиотеки с кратък размер на вмъкване (350 - 400 bp). Стойностите за K-полимерите се нанасят срещу честотата (оста y) на тяхното появяване (оста x). Най-лошият пресечен пик при ниска честота (1-2) се дължи главно на случайни фундаментални грешки в началните последователности. ° С ) Реконструирана филогения на 13 гръбначни генома. Съотношението dN/dS за всеки клон е обозначено в синьо. Числата в черно отговарят на стойностите за поддръжка на bootstrap. Лампата се използва като група. Дължината на клона се измерва в очакваните замествания на място. д ) Диаграма на Venn на генни клъстери за пет избрани гръбначни генома. Всяко число представлява броят на ортологичните генни семейства, споделени от споменатите геноми.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете изходните данни на Excel

резултатът

Сглобяване на генома

Геномът на тревата е съставен от 24 двойки хромозоми 18, 19 (2 n = 48). След като възприехме стратегия за секвениране на пълна геномна пушка, генерирахме приблизително 132 Gb последователности от последователности на Illumina върху геномна ДНК, изолирана от кръвта на гиногенетична трева за възрастни шарани и 136 Gb четения от див, заловен от вода възрастен мъж (Допълнителна таблица 1). и допълнителна бележка). Изградихме окончателни набори от женски (0, 90-Gb) и мъжки (1, 07-Gb) геноми, използвайки модифицирана тръба за ново сглобяване на Phusion-meta, както е описано по-рано 20 (Допълнителна фигура 1 и допълнителна таблица 2). Геномът на женския дизайн беше напълно анотиран към моята геномна информация (фиг. 1) и беше използван за закрепване на скелето към картата на генетичната връзка, докато мъжкият геном беше използван за откриване на вариация на последователността между мъжки и женски геноми.

Сглобката на женския геном имаше скелета с дължина N50 по-голяма от 6,4 Mb, а 90% от сглобките бяха съставени от 301 скелета, всички по-дълги от 179 kb (Таблица 1). Оценката на размера на генома с помощта на честотното разпределение на K-mer показа, че женският геном е около 891 Mb по отношение на размера на файла (Фигура 1b и Допълнителна бележка). Оценихме точността на геномното сглобяване, като подравнихме скелета с 3027 публикувани UniGene entires 5 и 11 BAC 21 (допълнителни фигури 2 и 3 и допълнителни таблици 3), което показва, че покритието на оригиналните контигели и скелета е приблизително 95% и 97 %, съответно. Грешките в последователността са предимно от вмъквания или изтривания, въведени от модула за кратко четене (Допълнителна таблица 3а).

Маса в пълен размер

Общо идентифицирахме общо 644 817 хетерозиготни SNP и 66 101 къси индела (10 нуклеотида с дължина или по-малко) в женския геном. Идентифицирахме 1465 819 SNP и 166 867 къси индола в мъжкия геном. Изчислената обща степен на хетерозиготност е приблизително 0, 9 и 2,5 полиморфизма на килобаза в женските и мъжките геноми (Допълнителна таблица 4). Ясно е, че дивият мъжки геном е имал много по-висока степен на хетерозиготност, което е причинило бимодалност в K -mer честотното разпределение (фиг. 1б) и по-малка дължина за сглобените скелета.

Анотация на генома

Изброили сме общо 27 263 гена, кодиращи протеина в женския геном. Доказателствата, използвани при генното предвиждане, включват данни за секвениране на 27 Gb РНК (RNA-seq) от 6 тъкани (ембрион, черен дроб, далак, мозък, бъбреци и бъбреци на главата), повече от 3000 известни записа на UniGene и информация за хомоложни гени на зебра (освобождаване Ensembl) 67, Допълнителна фигура 4, Допълнителна таблица 5 и Допълнителен набор от данни). В нашата анотация на некодиращи РНК гени (Допълнителни таблици 6 и 7) и 467 783 единични последователности (Допълнителна таблица), прогнозирахме 1538 тРНК, 24 рРНК, 207 малки ядрени РНК (snoRNAs), 136 малки ядрени РНК (snRNAs) и 444 микроРНК. 8). Повторната анотация de novo показва общо съдържание на повторение от 38% в сравнение с 43% в BAC (Допълнителна таблица 9). Това съотношение е по-малко от 52,2% от многократното съдържание, наблюдавано при зебра 3. Тази разлика може да се дължи на изключването на повтарящи се последователности, разположени в открити пространства и на малки фрагменти (3 .

Използвайки публикуваната карта за генетично свързване на шаран 4, ние закотвихме 114 скелета на 24 свързващи групи (фиг. 2а, Допълнителна таблица 10 и Допълнителна бележка), обхващащи 573 Mb (64%) от женската група със 17 456 (64%). локализирани анотирани гени. Синтезът на гени чрез закотвени скелета показа, че повечето групи за свързване на бял шаран имат обширна колинеарност със съответните хромозоми на зебра (фиг. 2б). Генното подреждане показва висок синтез на амур и зебра и до 24 018 гени амур (88% от общите 27 263 гени) са разположени върху синтетични блокове (Фигура 2в). Въпреки че този резултат беше подобен на предходния доклад 4, ние открихме два кръстосани хромозомни механизма за свързващи групи 22 и 24. Забележително е, че свързващата група 24 е подравнена с хромозомите 22 и 10 на данио, но не и с друга група за свързване на шарани. FISH анализ на хромозоми на бял шаран показа, че двата маркера на бял шаран, подравнени с хромозомите на зебра 10 и 22, наистина са били в една свързваща група 24 (фиг. 2г), което обяснява защо хромозома номер 25 е в зебра, но 24 в шаран.

а ) Скелета бяха закотвени на публикувана консенсусна карта 4. Сините редове показват дължината на всеки линкер (LG), към който са картографирани маркерите. Разстоянията на картата между маркерите са показани в скалата KosMC cM. Оранжевите ленти представляват закотвените скелета. Черните линии, свързващи маркерите и скелета, показват местоположението на маркерите върху скелета. Дължината на всяко скеле е показана по отношение на колона от 5 Mb. б ) Синтетична връзка между зебровите хромозоми и свързващите групи амур. Свързващата група 22 е подравнена с хромозоми 2 и 15 на данио и група 24 е подравнена с хромозоми 10 и 22 на зебра. ° С ) Колинеарност на гените между зебрите и шаранските треви. Хромозомите на Zebrafish са представени със сини блокове (например DR01). Скелета за шаран (дължина> 50 kb) са показани в оранжеви блокове. Изравнените гени са свързани със зелени линии. Дължините на хромозомите и скелета са показани по отношение на колона от 10 Mb скала. д ) Изследване на FISH линкер 24. Жълтият маркер CID1435 е разположен в района, подравнен с хромозома 10 на ребрата зебра, а червеният маркер CID0538 е подравнен с хромозома 22 на ребрата зебра. Скала, 5 μm.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете изходните данни на Excel

Еволюционен анализ

За да изследваме еволюцията на амур, ние групирахме генетични модели на амур с гени от други 12 геноми на гръбначни животни и използвахме 202 единични копия на гени с различно съответствие в различни геноми, за да реконструираме филогенетичното дърво (фиг. 1в и допълнително). Забележка). Като вид от семейство Cyprinidae, белият шаран е имал най-тясна връзка със зебрите. Според базата данни TimeTree 22, времето на разминаване между зебрите и амура се оценява на около 49-54 милиона години (допълнителна таблица 11). Повечето от избраните геноми на teleostei показват сходни селективни налягания според изчислените стойности на dN/dS (съотношението на скоростта на несинонимно заместване към скоростта на синонимното заместване).

Всички гени са участвали в GCSD или ZSD. Маршрутите бяха определени чрез търсене в пътната база данни на KEGG. Оста x показва броя на гените, участващи във всеки път. Синьо маркираните пътища подчертават метаболитните процеси, които са потенциално важни за развитието или адаптирането на диетата.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете изходните данни на Excel

Потенциален механизъм за определяне на пола

При сравняване на комплектите за мъжки шаран и женска трева, ние идентифицирахме 206 контига с обща дължина 2,38 Mb, носени от възрастен мъж, но не гиногенетична жена (допълнителна фигура 11 и допълнителни таблици 16 и 17). Всеки контиг е потвърден чрез PCR-базирано секвениране. Ние също амплифицирахме тези региони чрез PCR в разширена група от 24 мъже и 24 жени, като идентифицирахме чести хромозомни кръстоски между X и Y хромозоми в шарана (допълнителна фигура 12). Полът при шарана не може да бъде определен от цялата хромозома, а от няколко критични гена. Очевидно идентифицирахме сонда, специфична за мъжкия геном, която се картографира към един от контигите (сонда 184 на допълнителна фигура 12). Не намерихме последователно подравняване на този регион с друг геном на гръбначни животни, което предполага неговия уникален произход в шарана.

Транскрипционен анализ на прехода към хранителни навици

Шарановите треви обикновено са тревопасни, свойство, което ги прави популярен вид размножаване. Как амурът ефективно абсорбира хранителните вещества от растенията, за да подпомогне бързия им растеж, е изследователски въпрос без отговор 37. Белият шаран завършва прехода от месоядни към тревопасни диети, когато достигне дължина на тялото от 3 до 5,5 см, приблизително 1,5 месеца след излюпването. Анализирахме РНК-секвенция. Получено от червата, черния дроб и мозъка, за да характеризира вариациите в генната експресия преди и след промяната (фиг. 4а и онлайн методи). Гените с диференциална експресия са значително обогатени по пътища, свързани с циркаден ритъм в червата и с биосинтез на стероиди, биосинтез на терпеноиден гръбнак и метаболизъм на чернодробния глицерофосфолипид (DAVID Bioinformatics Resources 38; P

а ) Проектиране на FHT експерименти. 46 дни след излюпването, рибите, които не са били подложени на FHT (хранени с ларви на хирономид), са взети проби "46 d". Между 46 и 116 дни след излюпването рибите бяха разделени на две групи - едната хранена с хрилете, а другата все още хранена с ларви на хирономид - които бяха събрани на 116 дни след излюпването като "116 d - FHT" и "116 d". ( б ) Активиране на пътя на мевалонат и биосинтеза на стероиди. Сините и оранжевите стрелки показват реакционните стъпки по различни начини. Числото във всеки правоъгълник показва ЕС кода на ензима, катализиращ този трансфер. Червените кодове показват ензимни гени със значително повишена експресия след FHT (q 45), показан в хистограмите. Имената на съединенията са показани до съответните кръгове.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете изходните данни на Excel

След промяна в диетата е изключително важно белият шаран да поддържа непрекъснат ритъм на хранене, така че да може да получи достатъчно хранителни вещества от диетата си. Анализите на данни за чернодробна РНК-секвенция идентифицират значително активиране на пътя на биосинтеза на стероиди към мевалонат в биосинтеза на терпеноиден гръбначен стълб, което се отразява в средно ниво на експресия 32 пъти по-високо, отколкото преди промяната в диетата (q стойност 39 40, 41) че белият шаран, хранен с бълхи, има значително по-висок растеж от зеле, хранени с ларви на хирономид (риби преди преминаване и непроходими риби) по отношение на дължината на тялото, дължината на червата, телесното тегло и дължината на червата/дължината на тялото (данни не е показано) Метаболитната адаптация на тези пътища очевидно насърчава ефективното използване на растителни хранителни вещества в шарана.

В допълнение, в предишен доклад се посочва, че белият шаран, хранен с растителна диета, прекарва повече време в хранене 37. Също така забелязахме, че белият шаран, който е получавал растителна диета, се е хранил почти непрекъснато през целия 24-часов период. Анализите на данните от транскриптома показват, че гените, участващи в циркадния ритъмен път, се активират след преминаване на храна (FHT), което включва тактовия хетеродимер - bmal1 и гените ror и clock (Допълнителна фигура 15а). Свързаните гени показват голяма прилика с гените на зебра (като гените rorca 42 и clocka 43), с изключение на някои промоторни области на гени, носещи различни елементи (Допълнителна фигура 15b). Въпреки че връзката между гените, участващи в циркадния ритъм, и непрекъснатото хранене не е ясна, това откритие може да подскаже, че честотата на хранене трябва да се изследва по време на промяната в диетата на шарана.

Изследвахме отчитания на не-амур за потенциални чревни микробиоти, като премахнахме всички РНК-sq чревни показания, съобразени със сглобките от амур (Допълнителни таблици 20 и 21 и Допълнителна бележка). Този анализ не идентифицира никакви гени, кодиращи предвидените ензими, усвояващи целулозата в червата, което предполага, че червата на амур може да не смила и да абсорбира целулоза, засилвайки схващането, че целулозата може да се развие като водна добавка за насърчаване на растежа на амур. 44. Въпреки това е вероятно последователността на чревната биота да бъде по-силна, за да се разбере как шаранът смила растителните материали.

дискусия

Създадохме два комплекта от генома на амур, мъжки и напълно анотиран женски. Сравнението на голям брой генни модели и анализ на синтеза показа, че зебрата и амурът имат подобна история на генома. Хромозомното сливане, което води до свързване на група 24 и появата на GCSD, може да е отговорно за значителни разлики в развитието (напр. Размер на тялото) и други характеристики (напр. Определяне на пола) между амур и зебри. Характеризирането на транскриптите, свързани с диетичните промени, предостави нова геномна информация за метаболитната адаптация на шарана към прехода към вегетарианска диета през целия му живот. Тези геномни последователности също водят до разпространението на амур до геномната фаза.

методи

Подготовка и секвениране на ДНК библиотека.

Геномна ДНК беше изолирана от кръвните клетки на възрастен шаран от възрастни гиногенетични шарани и трева за диви шарани от див плен, използвайки DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen). Подход 46 без усилване беше използван за подготовка на библиотеки с последователности с къси вмъквания от 350 до 450 bp за сдвоени показания съгласно протокола на производителя за Illumina. Протоколите на Mate-Pair Library v2 Sample Preparation Manual (Illumina) и сдвоеният край се използват за изграждане на библиотеки с размери на вмъквания 1, 3, 5 и 8-10 kb за сдвоени показания (Допълнителна фигура 16). Наръчникът за подготовка на библиотеката (Roche) е комбиниран. Необработени данни са генерирани от секвенсера Illumina HiSeq 2000 и секвенсера Illumina Genome Analyzer IIx.

Сглобяване на последователност.

Разработен е de novo монтажен конвейер за компилиране на кратките стойности (допълнителна фигура 1), който е модифицирана версия на метода Phusion-meta, както бе споменато по-рано 20. Накратко, когато бяха счетени сдвоени краища, за да се елиминират лошите показания, съдържащи десет или повече уникални K-полимери, те бяха групирани в хиляди групи, използвайки Phusion2 с K -mer, настроен на 51 bp. Показанията, групирани във всеки клъстер, бяха подредени паралелно в контигове ABYSS 47, fermi 48 и SOAPdenovo 49. Всички тези contigs бяха обединени, за да се създаде първоначален дизайн на contig. Контигенни контигуси бяха получени чрез подравняване на всички показания обратно към чернови контигове с помощта на инструмента за управление на сглобката GAP5 (реф. 50). След това двойките четени двойки бяха йерархично и итеративно съединени в contigs за изграждане на предварителни SOAPden скелета (K -mer зададен на 61 bp). Окончателното скеле беше извършено с помощта на Spinner.

Предсказване на протеини, кодиращи гени.

Пренаписване на последователности.

Шест тъкани (ембрион, черен дроб, далак, мозък, бъбреци и глава) бяха събрани от възрастни мъже и получените данни бяха използвани за моделиране на гени. Всички тези проби, както и проби от експериментите с FHT, бяха подложени на РНК изолация, използвайки SV TRIzol реагент (Invitrogen). Поли (А) + иРНК се пречиства с помощта на комплект за пречистване на иРНК DynaBeads (Life Technologies). Сдвоени cDNA библиотеки са конструирани с помощта на комплекта за подготовка на пълна библиотека Seq NGS RNA RNA (Gnomegen). Получените сдвоени cDNA библиотеки бяха секвенирани с помощта на система Illumina HiSeq 2000.

Идентифициране на мъжки контиги, разположени на потенциална полова хромозома.

Мъжки контиги (дължина> 500 bp) бяха подравнени с женски контиги (дължина> 500 bp) с помощта на MUMmer 53 подравнител с параметри по подразбиране. След това се изчислява обхватът на всеки мъжки контиг от женските, като се използва праг на идентичност> 95% и се изисква всяка неравна пролука в подравнената област да бъде дълга 54, за да се измерва дигитално диференциално изражение в коментираните локуси. Когато генната експресия се увеличи или намали в 116 d - FHT черен дроб повече от два пъти (q стойност 39