криопорите

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Структурно определяне на порите на лизенин
  • Архитектура на сглобяване на лизенин
  • P-цилиндрова структура
  • Взаимодействие с липиди
  • Преход към състоянието, вмъкнато в мембраната
  • дискусия
  • методи
  • Производство и пречистване на рекомбинантни протеини
  • Тест за хемолиза
  • Сглобяване на пори от лизенин
  • Подготовка на проби и събиране на данни
  • Обработка на изображение
  • Създаване и подобряване на модели
  • Препарат за поддръжка на образец от графенов оксид
  • стъпки
  • Банка данни за електронна микроскопия
  • Банка с данни за протеини
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителни изображения
  • видеоклипове
  • Допълнителен филм 1
  • Коментари

елементи

  • Криоелектронна томография
  • Надмолекулно сглобяване

абстрактно

Лизенинът от целомичната течност на земния червей Eisenia fetida принадлежи към семейството аеролизини, малки токсини, образуващи β-пори (β-PFT), някои от които са патогенни за хората и животните. Въпреки усилията структурата на тази група протеини с висока разделителна способност е неуловима и следователно механизмът на активиране и вмъкване в мембраната остава неясен. Тук определяме порестата структура на лизенина, използвайки кристална ЕМО с една частица с разделителна способност 3,1 Å. Измервателният възел разкрива дълъг ß-цилиндров канал, който се простира отвъд дължината на комплекса и който неочаквано съдържа две влакна преди поставяне, облицоващи хипотетична мембрана за вмъкване. Изследването на други членове на семейството на аеролизините разкрива висока структурна консервация в тази област, което предполага, че пътят за доставяне на мембраната в това семейство се поддържа. За някои токсини протеолитичното активиране и отстраняване на пептида ще улесни развитието на предварително вмъкнати влакна, позволявайки им да образуват β-цев на канала.

Лизенинът, защитният протеин на плода от земни червеи Eisenia, се произвежда в темоцити в телесни течности, които са част от имунната система на земята 1. Той е член на семейството на β-порообразуващите малки токсини (β-PFT) аеролизини, които съдържат ключови фактори на вирулентност на голям брой бактериални патогени, като аеролизин, произведен от Aeromonas spp 2, Clostridium perfringens epsilon токсин 3 и Clostridium septicum α-токсин 4, докато Bacillus thuringiensis параспорин-2 има цитоцидна активност срещу човешки ракови клетки 5. Въпреки хомологията на структурата с ниска последователност, техните водоразтворими мономерни форми разкриват, че всички те споделят структурно запазен домейн, наречен пореобразуващ модул (PFM), за който е известно, че допринася за порите на 6-цилиндъра.

Подобно на повечето PFT, лизенинът се секретира като неактивен, водоразтворим мономер 7. При свързване със сфингомиелин (SM) в еукариотната клетъчна мембрана, токсинът претърпява значителни промени в своята вторична структура 8 и образува олигомерни пори на повърхността на мембраната, както се определя от електронна кристалография 9 и високоскоростни атомно-силови микроскопични изследвания 10, 11, преди до вмъкване в мембраната за образуване на пори и последващ лизис на клетки 12, 13 .

Кристалната структура на мономерния лизенин разкрива, че токсинът е организиран в два основни структурни домена: (1) удължен PFM в N-края, който съдържа SM свързващо място, както и мембранна вмъкната верига, за която отдавна се смята, че е регион; който се реорганизира в β-фиби по време на вмъкване на мембрана и (2) С-терминален бета-трефол домен, който кристализира, свързан с фосфохолин (POC) 9. Изследването на структурата на SM-свързания мономерен лизенин разкрива, че за свързването на токсините са необходими както основната POC група, така и единият край на SM ацилната верига.

Въпреки че в миналото са идентифицирани няколко структури за мономерни форми на токсини от семейство аеролизини 2, 3, 5, 9, 14, 15, 16, 17, 18, не е дадена атомна структура за техните активни порови форми. Тук представяме структурата на лизенин в неговата неамериканска вградена в мембрана крио-ЕМ форма с единични частици с разделителна способност 3.1 Å. Структурата осигурява първи поглед върху атомната разделителна способност на вмъкнат с мембрана член от семейството на аеролизините и предоставя информация за това как други членове на това семейство могат да бъдат активирани и сглобени в съответните им форми на порите.

резултатът

Структурно определяне на порите на лизенин

Повърхностно представяне на изострена 3,1 Å карта на лизенин, показана отстрани ( а ) и извънклетъчни изгледи ( б ). Плътностите на страничната верига са ясно видими в порите на ß-цилиндъра. Съобщават се три домена на субединицата на лизенин: β-фиби (маслини), капачки (розови) и рецептор-свързващи домени (циан). Представителна криоелектронна микрография на лизенинови комплекси върху графенов оксид ( ° С ), получени при размазване от -2,3 μm на FEI Titan Krios с детектор на върха Gatan K2. Характерни средни стойности за 2D клас лизенин олигомер ( д ). Скала, 20 nm.

Изображение в пълен размер

Архитектура на сглобяване на лизенин

Карикатурна илюстрация на лизин, показана отстрани ( а ) и извънклетъчни изгледи ( б ). Трите домена на лизенин са оцветени, както е на Фигура 1: β-фиби (маслини), капачка (розово) и рецептор-свързващ домен (циан). Размерите на комплекса и порите са показани като Cα-Cα измервания, а приблизителното местоположение на двуслоя е нанесено с групите фосфолипидни глави, показани в оранжево, а хидрофобното ядро ​​в сиво. Ароматните пръстени Phe70 и Tyr79 са изброени в лентата, както и остатъците от хистидин директно над пръстена Tyr79. Остатъците от местата за свързване на фосфохолин (POC) са показани като сфери, а звездичка показва гъвкава намотка, свързваща свързващия домейн на рецептора с домейна на капачката. ( ° С ) Повърхностно представяне на филтрирано по Гаус филтърно покритие (лилаво) около заострена карта на лизенин. д ) Внимателен поглед върху извънклетъчната страна на лентата за детергент, която подчертава трите остатъка от хистидин.

Изображение в пълен размер

P-цилиндрова структура

Взаимодействие с липиди

Мономерният лизенин преди това кристализира, свързан с SM и POC 9 лиганди, въпреки че тези структури очевидно са във водоразтворимо състояние. POC беше кристализиран, свързан със С-крайния β-трилистен домен на лизенин в джоб, фланкиран от Lys185, Ser227, Gln229, Tyr233 и Tyr282 (справка 9). Под формата на пори на лизенин, този джоб е идеално разположен за взаимодействие с фосфатидилхолин или SM главни групи, тъй като се намира на върха на рецепторния свързващ домен директно над целевата клетъчна мембрана (Фигура 2а, "POC"). SM е идентифициран свързан с N-крайния PFM и остатъците, които взаимодействат с SM в мономерната структура (Lys21, Tyr24, Tyr26, Gln117 и Glu128), са погребани в порите на лизенин (Допълнителна фигура 4d). В допълнение, не открихме допълнителни липидно-съответстващи плътности в симетризираната карта C9 или в асиметричната реконструкция на лизенин 4, 2 Å. Възможно е разпознаването на SM на това място да се случи преди олигомеризация и вмъкване в мембраната, както вече беше предложено 9. Възможно е също така, че високите концентрации на детергент, използвани за ефективно извличане на порите от липозомите, биха могли да дисоциират всякакви свързани липидни молекули от алтернативното SM свързващо място в лизениновата пора.

Преход към състоянието, вмъкнато в мембраната

Фигура 3 и допълнителният филм 1 показват структурно разположение между разтворимата мономерна структура (Фигура 3а) и нейното олигомерно състояние, вградено в мембраната (Фигура 3b). Висящата еластична намотка между Val157 и Arg159 (фиг. 3a, b, сфери) обръща N-крайната капачка на домейна с

20 Å (фиг. 3в) и се завърта навътре към средния лумен с 35 ° (фиг. 3d). Вертикалният колапс е в съответствие с AFM наблюденията на лизенин върху равнинните двуслойни слоеве, които установяват намаляване на височината до 3 nm, когато се поставят в мембраната 10. Това движение индуцира огъване в средата на относително плоския домен на разтворимия мономер (фиг. 3Ь, пунктирани линии) и води до това, че всеки домен на капачката е разположен в горната част на домена на съседната единица за свързване на рецепторния домен (допълнителен филм 1). Β-фиби изискват пълно преобразуване на 5 β-нишки и 3 10 PFM мономер лизенин спирала 9 в 2 нови β-нишки, както е подчертано на Фигура 3а, b. Β-шпилката започва близо до извънклетъчната страна на лумена на порите и кривата към вътреклетъчната страна с почти 270 ° (фиг. 3d). По този начин порите на лизенин от В-цилиндър се състоят от три пъти повече полипептид, отколкото се смяташе първоначално (24 остатъка) 9 .

а ) Карикатурно представяне на лизенин мономер (PDB ID 3ZXD) и неговото мембранно състояние ( б ) с двете молекули, подравнени по отношение на рецепторния свързващ домен в посочената ориентация (вмъкнато). Пунктирани линии vb указват огъването в областта на капачката и остатъците на пантите (Val157 - Arg159) са показани като сфери. Цветовата схема е показана на ФИГ. 2а с маркирани N- и С-краища. Представяне на скования наслагван водоразтворим мономер (циан) и неговата форма, вмъкната в мембраната (маслина) по отношение на свързващия домейн на рецептора, както се вижда отстрани ° С ) и извънклетъчния изглед ( д ). Звездичките сочат към Ser31 и в двете структури. Показани са 20 Å спад във височината и 35 ° завъртане към лумена на домена на капака.

Изображение в пълен размер

дискусия

Крио-ЕМ структурата на 315 kDa на порите на лизенин при разделителна способност 3.1 Å представлява първата пореста структура на атомната разделителна способност за член на малкото β-PFT семейство аеролизини, разкриваща прехода на водоразтворим мономер към неговата вградена в мембраната повърхност, олигомерно състояние. Структурата осигурява рамка за бъдещи изследвания за това как други членове на това семейство могат да постигнат образуването на пори и проправя пътя за проектирането на нови терапевтични средства, насочени към функционално нарушаване на образуването на пори за това семейство.

Сравнение на водоразтворимата мономерна структура на лизенин с три други членове от семейството на аеролизините. Предполагаемите области, допринасящи за 3-цилиндрите в аеролизин (1PRE), епсилон токсин (3ZJX) и параспорин-2 (2ZTB), са оцветени в зелено за предвидените по-рано мембранни контури и в жълто за кримпваните предварително влакна, идентифицирани тук. проучване. Взети заедно, тези региони образуват β-цилиндъра на пората на лизенин. Двете влакна преди въвеждане обикновено са разположени на ръба на токсините и са изолирани от основното тяло (сиво). В случай на аеролизин и епсилон токсин, предварително вмъкнатите влакна участват в β-листове с CTP (червено), като по този начин стабилизират разтворимото мономерно състояние. В параспорин-2, N-крайният пептид, който не присъства в кристалната структура на активирания токсин, има най-голям ефект върху активността на токсина и се смята, че взаимодейства с контура за вмъкване, като по този начин действа като предпазна ключалка .,

Изображение в пълен размер

Методът за вмъкване на лизенинова мембрана, идентифициран в това проучване, е подобен на този на семейството на α-хемолизин на малки βPFTs. Стафилококовите хемолизини и клостридиалният токсин NetB претърпяват просто удължаване на областта пред стъблото, което се вмъква срещу β-сандвич домена, за да образуват β-цилиндрични пори без значителни промени в останалата част от структурата 23, 25, 26 35. Този механизъм е забележително запазен в това семейство, дори когато симетрията, стехиометрията на субединицата и регионите за свързване на рецепторите се различават 27. По подобен начин влакната за предварително вмъкване на лизенин се развиват от PFM и се подреждат в дълъг β-цилиндър. Въпреки това, за разлика от α-хемолизина, лизенин PFM претърпява конформационна промяна, която води до колапс

20 Á и вътрешно уплътняване (допълнителен филм 1). Моделът на порите за аеролизин, предложен от Degiacomi et al.31, получен от 18A крио-ЕМ карта, комбинирана с молекулярна динамика на мутанти, блокирани в предпори и квазипорести конформации, също има прилики с лизиновата структура на порите в това, че общата подреждане на домейн 2 за свързване на рецептора и PFM (домейни 3 и 4) са разположени подобно на лизенин. Въпреки това, удължаването на аеролизин β-фиби може да започне, както в случая с лизенин, в горната част на PFM и може да включва влакна преди вмъкване. Когато по-порьозните структури от семейството на аеролизините се решат с висока разделителна способност, ще стане по-ясно как тези токсини се променят и до каква степен са запазени механизмите на вмъкване.

Въз основа на нашите открития и предишна работа в областта, моделът за образуване на пори на лизенин, показан на ФИГ. 5. Първоначалното свързване на разтворими мономери с мембраната ще бъде опосредствано чрез рецепторния свързващ домен с основните POC групи (фиг. 5а) (препратка към 9 и това проучване). Освен това помага за ориентирането на токсина преди образуването на пори. Разпознаване на SM също може да възникне в този момент. Това ще бъде последвано от олигомеризация до състоянието преди порите (Фиг. 5b), както е идентифицирано от AFM 10, 36 и електронна кристалография 9, чрез взаимодействие мономер-мономер, което може да предизвика развитието на β-косми до по-ниско енергийно състояние . и позволяват по-тясно опаковане на мономерите. Олигомеризацията, стъпка, която е задължителна преди образуването на пори за всички p-PFTs, характеризирани досега, гарантира наличието на достатъчен брой β-фиби за образуване на канали 9 и задоволява хидрофобна среда като водородна връзка за β-влакното, напр като липиден бислой 37. И накрая, образуването на β-цилиндър образува пори в двуслоя (фиг. 5в), което води до нарушаване на мембранната хомеостаза и в крайна сметка до лизис на клетките.

( а ) Лизениновите мономери (PDB ID 3ZXD) първоначално ще се свържат с целевата клетъчна мембрана чрез взаимодействия между рецепторния свързващ домен и основните POC части. ( б ) След свързване с мембраната, увеличаването на локалната концентрация на мономери ще насърчи олигомеризацията, което ще доведе до предварително образуване на пори. В зависимост от ориентацията на мономерите, височината на порите може да бъде до 100 Å (дължина на лизенин мономера). ( ° С ) Натоварената с мембрана форма на лизенин, разтворена в това проучване, се простира на 65 Å над мембранната повърхност. Показаната тук хипотетична предварителна пора е конструирана чрез вграждане на деветкратна симетрия в мономерна кристална структура, подредена по отношение на рецептор-свързващ домен във форма, вградена в мембрана.

Изображение в пълен размер

методи

Производство и пречистване на рекомбинантни протеини

Тест за хемолиза

Сглобяване на пори от лизенин

Подготовка на проби и събиране на данни

Пробите бяха потопени в замразяване с помощта на конвенционално произведено бутало при 4 ° С. Лизениновите олигомери (3 μl 0,2 mg ml -1) бяха нанесени върху Quantifoil R1.2/1.3 решетъчна медна решетка (Quantifoil Micro Tools, GmbH) със слой от квадратна мрежа (Quantifoil Micro Tools, GmbH), покрита с графенов оксид (виж по-долу) и оставена да залепне за 30 s. След това решетките се попиват от пробата за 10 секунди и след това се потапят в течен етан. Пробите са изобразени на FEI Titan Krios електронен микроскоп, работещ при ускоряващо напрежение 300 kV. Микрографиите са записани в режим с висока разделителна способност, като се използва директен електронен детектор Gatan K2 Summit в края на енергиен филтър Gatan Quantum в режим на нулеви загуби и широчина на ширината на процепа с избор на енергия от 20 eV. Общата доза в пробата е 47 e - до Å2, фракционирана върху 20 изображения с калибриран размер на пикселите 0,715 Å за микрофотографии с висока разделителна способност.

Обработка на изображение

Създаване и подобряване на модели

Кристалната структура 9 на лизенин от див тип (PDB ID 3ZXD) беше използвана като шаблон за de novo моделиране на N-края след остатъците С-терминал 150, които образуват домейна, свързващ β-трилистния рецептор. Изграждането на всички модели беше извършено в Coot 45. В модела липсват 9N-терминални остатъци, за които не можахме да видим плътност. Усъвършенстване на модела за подобряване на напасването, геометрията и сблъсъците на атомите беше извършено с помощта на REFMAC 5.8 (реф. 46) с некристалографски ограничения на симетрията, за да се отчетат деветкратните ограничения на симетрията и вторичната структура, генерирани от PROSMART 47. Извършена е кръстосана проверка на параметрите за усъвършенстване, използвани за избягване на прекалено приспособяване, чрез прецизиране на модела спрямо първата нефилтрирана половин карта и сравняване на FSC на същия модел спрямо двете половин карти (допълнителна фигура 4b).

Препарат за поддръжка на образец от графенов оксид

Дисперсията на графеновия оксид в H20 (Sigma) се разрежда до 0,2 mg ml -1 в H20 и се върти при 300 g в продължение на 30 s за отстраняване на големи агрегати. Решетките Quantifoil R1.2/1.3 се изпускат за 1 минута и 3 μl от графеновата суспензия се добавят към решетките за 1 минута. Наскоро решетките бяха попити за кратко с помощта на филтърна хартия Whatman No1 и измити три пъти по 20 μl капки вода (два пъти от графеновата страна и веднъж от обратната страна). След това решетките бяха използвани за дълбоко замразяване без допълнителна обработка.