Резюме 1980 Нефрологична платформа, неделя, 5/2
Намалената екскреция на цитрат с урината, важна причина за камъни в бъбреците, се появява при CMA или хипокалиемия (нискоК). Микроперфузионните проучвания показват, че основната регулация на пикочния цитрат е реабсорбцията на проксималния тубуларен цитрат. ATP CL, цитозолният ензим, отговорен за разцепването на цитрат до оксалоацетат и ацетил-КоА, играе важна роля в развитието на хипоцитратурия (J Clin Invest 98: 2381). CMA и lowK повишават активността на ATP CL и протеина в бъбречната кора. Не е известен обаче конкретният тръбен сегмент, при който се наблюдава това увеличение. Освен това е доказано, че прилагането на специфичен ATP инхибитор CL, 4S-хидроксицитрат, повишава цитрата. Целта на тези проучвания е да се идентифицира частта от бъбреците, отговорна за наблюдаваното увеличение на бъбречния кортикален ATP CL протеин и да се изследва ефектът на 4S-хидроксицитрат върху активността и изобилието на ATP CL.
Мъжки плъхове, 180-220 g, бяха поставени в отделни метаболитни клетки. Контролните животни са получавали вода ad lib и са били хранени с двойки от кошари за плъхове, експерименталните животни са получавали 0.28 M NH 4 Cl вода, ad lib. След 7 дни животните се измиват при 300 torr с 3% параформалдехид и 0,05% пикринова киселина в 0,1 М какодилатен буфер с 10% Pentaspan® (DuPont). Бъбречните секции бяха фиксирани в 10% формалин и нарязани на 3 μ секции. Етикетирането на имунопероксидазата се извършва с помощта на комплект Vectastain® ABC (Vector Laboratories, Калифорния). Първично заешко анти-плъхово антитяло, използвано преди това за имуноблотинг, се използва в разреждане 1: 200.
За проучвания, използващи ATP CL инхибитор, на плъхове се прилагат нормални плъхове и NH 4 Cl вода, ad lib. След 7 дни на животните се прилагат 2 mmol/kg/ден чрез сонда с CitrinK-Mg® (Sabinsa, Ню Джърси). След 2 дни животните се умъртвяват и перфузират, както е описано по-горе. Единият бъбрек е притиснат и отстранен преди перфузия, за да се определят активността на ATP CL и нивата на протеин както преди.
Резултатите от нашата имунохистохимия показват, че ATP CL протеинът се намира в нефрона. Въпреки това, при животни с CMA, 3-кратно увеличение на оцветяването се е случило само в проксималния сегмент на тубулите, особено на ръба на четката. При проучвания с животни, получаващи ATP CL инхибитор, цитратът в урината е увеличен петкратно. Няма обаче разлика в CL ATP активността (в nmol хидроксамат/mg протеин/30 минути; 132 ± 16 срещу 134 ± 14) или ATP CL протеин чрез имуноблотинг. В заключение, инхибирането на ATP CL от 4S-хидроксицитрат, наблюдавано in vivo, не продължава in vitro. Чрез имунохистохимия, ATP CL протеинът се намира в целия нефрон. Увеличението на проксималния тубуларен ATP CL имунооцветяване, наблюдавано при CMA плъхове, дава допълнителни доказателства за важността на този ензим и този тубулен сегмент за развитието на хипоцитратурия.