абстрактно

Основното

За лечение на гломерулонефрит, времето и продължителността на приложението на лекарството трябва да се основават на точна оценка на локалното микроскопично възпаление. Въпреки че за тази цел често се използват серологични и пикочни маркери, тези параметри не отразяват пряко възпалителната активност. Протеините с остра фаза, включително С-реактивен протеин, не са полезни маркери за проследяване на гломерулното възпаление. Настоящият, най-надежден метод за оценка на гломерулонефрит е хистопатологичният анализ, използващ бъбречна биопсия. Въпреки това, тъканната биопсия е инвазивна с риск от усложнения като масивно кървене. Освен това не позволява последваща оценка, която често е необходима при нестабилен, променлив гломерулонефрит. Понастоящем не са налични технологии за непрекъсната неинвазивна оценка на гломерулното възпаление. В този доклад се фокусирахме върху създаването на in vivo генетичен биосензор, подходящ за тази цел.

По-рано описахме ex vivo подход за трансфер на ген, който конкретно е насочен към гломерулите. 1 Този метод използва гломерулна мезангиална клетка като вектор за доставка на ген. Тоест, мезангиалните клетки бяха култивирани от изолирани гломерули, стабилно трансфектирани с чужди гени in vitro и прехвърлени обратно в гломерулите чрез бъбречната циркулация. Инжектираните клетки се разпределят през инжектирания бъбрек и селективно се натрупват в гломерулите. Устойчивата клетъчна преживяемост и експресията на трансгени се поддържат поне няколко седмици. Използвахме този подход за клетъчно предаване, за да създадем локален биосензор, който възприема и отчита гломерулна възпалителна активност.

Както бе споменато по-горе, SRE може да служи като молекулярен сензор за гломерулонефрит. Въпреки това, активността на промотора на SRE за стимулиране на експресията на чужди гени е относително слаба в мезангиалните клетки. Следователно в този доклад ние използвахме алтернативен елемент на възпалителния отговор, усилващ елемент KB, като сензор за гломерулонефрит. Ядреният фактор -KB (NF-kB) е повсеместен, плейотропен транскрипционен фактор, който участва в различни възпалителни процеси. 9, 10 По време на експериментален и човешки гломерулонефрит се активира NF-κB, 11, 12, 13, което води до експресията на гени, свързани с възпаление в гломерулните клетки. 14, 15 KB подобрителният елемент трябва да бъде полезен като сензор за гломерулонефрит.

В този доклад предоставяме експериментални доказателства, че локалното възпаление може да се наблюдава неинвазивно чрез локално генериран биосензор. Използвайки гломерулонефрит като модел на заболяването, ние демонстрираме възможността за използване на сензорната система K B-SEAP за непрекъснато наблюдение in vivo на локално микроскопско възпаление.

Материали и методи

Клетки и реактиви

Мезангиалните клетки (SM43), генерирани от изолирани мъжки гломерули от плъх на Sprague-Dawley 1, се поддържат в среда, съдържаща 5% фетален говежди серум (FBS). Обикновено за проучванията се използва среда, съдържаща 1% FBS. Циклофосфамид монохидрат е закупен от Wako (Осака, Япония). Човешки рекомбинантен IL-1β и TNF-α бяха щедри дарения от Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd (Токушима, Япония) и Dr. Кацуо Ногучи (Медицинско училище в университета Тейкьо, Токио, Япония).

Стабилна трансфекция

SM/NF-kB B-SEAP5 сензорният клетъчен сензор се определя чрез котрансфекция на SM43 клетки с pNF-kB B-SEAP (BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA) и pcDNA3.1. (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), както е описано по-горе. 16 pNF-kB B-SEAP кодира SEAP под контрола на четири копия на kB подобрителния елемент. Мокет-трансфектираните мезангиални клетки, експресиращи нео, се определят чрез pcDNA3.1 трансфекция. Мезангиалният клетъчен фенотип на установените клетки е потвърден чрез положително оцветяване за α-гладкомускулен актин и Thy 1, 1, използвайки моноклонално антитяло срещу α-гладък мускул актин (разреждане 1: 300; Sigma, St Louis, MO, USA) -Ти 1.1 моноклонални антитела 1-22-3 (5 ug/ml), съответно 17.

Анализ на Северно петно

Общата РНК се екстрахира чрез едноетапен метод, и се извършва анализ на Northern blot, както е описано по-горе. 19 Като SEAP сонда, 1.5 kb Hind III-XbaI фрагмент от pSEAP2-контрол (BD Biosciences) беше радиомаркиран и използван за хибридизация. Експресията на глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа се използва като контрола на натоварването.

Тествайте SEAP

SEAP активността се оценява по метода на хемилуминесценция, като се използва Great EscAPe SEAP комплект за откриване (BD Biosciences). Накратко, 5 μl хранителна среда или плъхов серум се смесват с 15 μl 1x буфер за разреждане и се инкубират при 65 ° С в продължение на 30 минути. След инкубация пробите се смесват с 20 μl пробен буфер, съдържащ L-хомоаргинин, оставят се за 5 минути при стайна температура и след това се добавят 20 μl хемилуминесцентен усилвател, съдържащ 1,25 mM CSPD хемилуминесцентен субстрат. След инкубация на тъмно в продължение на 30 минути, пробите се измерват за SEAP активност, като се използва луминометър (Gene Light 55; Microtech Nition, Funabashi, Chiba, Япония).

Пресичане на проучване

Кондиционираните среди бяха приготвени от изолирани нормални и нефритни гломерули на плъхове. За да се получи последният гломерулонефрит против Thy 1, моноклонално антитяло 1-22-3 17 се индуцира при възрастни мъжки плъхове Sprague-Dawley, както е описано по-горе. 4 дни след инжектиране на антитяло, гломерулите се изолират и 1 х 104 гломерули се инкубират в продължение на 24 часа в 1 ml хранителна среда, съдържаща 1% FBS. Кондиционираната среда се събира, центрофугира за отстраняване на неразтворими вещества и се използва за кръстосани изследвания. Накратко, сензорните клетки бяха изложени на 1: 1 разредена (50%) кондиционирана среда в продължение на 24 часа и културалната среда беше събрана за SEAP анализа.

Ex Vivo Sensing гломерулонефрит

Сензорни клетки (1 х 106) бяха трипсинизирани и инжектирани в лявата бъбречна артерия на нормални плъхове или нефритични плъхове, изложени на анти-Thy 1 гломерулонефрит (ден 1), както е описано по-горе. 1, 4, 21 След инжектиране на клетки, гломерулите се изолират от двата бъбрека, използвайки конвенционален метод на пресяване. Всички 1000 гломерули се инкубират в 100 μl среда, съдържаща 1% FBS, и след 12 часа средата се събира за SEAP анализ. За да се изследва възможният директен ефект на анти-Thy 1 антитялото върху SEAP секрецията в сензорни клетки, клетките бяха третирани с 1-22-3 (0,5 - 5 ug/ml) в продължение на 24 часа и SEAP активността беше оценена.

Оценка на ефективността на клетъчния трансфер

Ефективността на трансфера на сензорни клетки в гломерули беше оценена, както е описано по-горе. Накратко, трипсинизираните клетки (1 х 106) бяха оцветени с флуоресцентно багрило 1,1'-диоктадецил 3,3,3 ', 3'-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат (DiI; Molecular Probes, Eugene, OR, USA; 4 μ g/ml ) при 37 ° С в продължение на 30 минути и се инжектира в лявата бъбречна артерия на плъхове. След възстановяване на бъбречната циркулация и двата бъбрека бяха отстранени и използвани за приготвяне на изолирани гломерули. Изолираните гломерули се подлагат на флуоресцентна микроскопия, за да се оцени процентът на DiI-положителни гломерули.

In vivo наблюдение на гломерулонефрит

Плъховете бяха разделени на четири групи: нормални плъхове, нормални плъхове, инжектирани със сензорни клетки, нефритни плъхове и нефритни плъхове, инжектирани със сензорни клетки. В групи, инжектирани със сензорни клетки, 1 x 10 6 SM/NF-kB B-SEAP5 клетки са инжектирани в лявата бъбречна артерия на нормални плъхове или нефритни плъхове, изложени на анти-Thy 1 гломерулонефрит (ден 1). Серумите се събират преди и 1, 3, 6, 8 и 10 дни след инжектиране на клетки и се подлагат на SEAP анализ. За да се тества дали сензорните клетки възприемат и записват само локално възпаление там, където се намират сензорните клетки, 1 x 106 сензорни клетки се инжектират интраперитонеално интраперитонеално в нефритни плъхове и серумни нива на SEAP се изследват до 9 дни. Всяка експериментална група включва поне четири плъха.

За да се потвърди, че инжектираните сензорни клетки оцеляват в гломерулите по време на проучването, гломерулите се изолират от двата бъбрека в края на всеки експеримент (ден 10) и се култивират в присъствието на 10% FBS. Растящите клетки бяха избрани при 330 ug/ml G418, фиксирани с 1% формалдехид и оцветени с хематоксилин, за да се визуализират устойчиви на неомицин клетки.

При плъхове интраперитонеалното инжектиране на имуносупресивен циклофосфамид причинява> 98% изчерпване на циркулиращите левкоцити в рамките на 2 дни, което води до потискане на гломеруларното възпаление и протеинурията при експериментален гломерулонефрит. За да се определи дали терапевтичната интервенция при гломерулонефрит води до намаляване на серумния SEAP, плъховете се инжектират интраперитонеално с циклофосфамид (165 mg/kg телесно тегло) 2 дни преди инжектиране на сензорни клетки. След 3 дни (Thy 1 гломерулонефрит, ден 2) серумите бяха събрани от третирани с циклофосфамид (+) и нетретирани (-) нефритни плъхове и подложени на SEAP теста.

Изследване на имунофлуоресценцията

Приготвени бяха замразени срезове с дебелина 8 μm и инкубирани с анти-плъхове моноклонално антитяло ED1 (разреждане 1: 200; Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA) за 60 минути. След измиване срезовете се инкубират с конюгирани с Alexa Fluor 488 антимиши имуноглобулини (1: 1500 разреждане; Молекулярни сонди) в продължение на 60 минути и се подлагат на флуоресцентна микроскопия. Броят на ED1-позитивните клетки на пълен размер гломерул беше преброен и средните стойности бяха използвани за сравнение в различни групи.

Статистически анализ

Данните са изразени като средно ± se. Статистическият анализ беше извършен чрез непараметричен U-тест на Ман-Уитни. P

неинвазивно

Сензорно клетъчно засичане на проинфламаторни цитокини. Клетките на манган от плъх бяха стабилно трансфектирани със секретирания ген на алкална фосфатаза (SEAP) под контрола на KB подобрителни елементи и беше генериран чувствителен към възпаление SM/NF-kB B-SEAP5 клон. а ) Имунофлуоресцентно оцветяване за мезангиални клетъчни маркери, α-актин на гладката мускулатура и Thy 1.1. NC, отрицателен контрол. ( б ) Northern blot анализ на SEAP експресията в изложени на цитокини сензорни клетки. Клетките бяха изложени на IL-1β (10 ng/ml) или TNF-a (250 U/ml) в продължение на 24 часа и беше оценена експресията на иРНК на SEAP. Експресията на глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPHD) е показана като контрол на натоварването. ( ° С ) SEAP секреция от изложени на цитокини сензорни клетки. Клетките се третират с IL-1β или TNF-a в продължение на 24 часа и SEAP активността в хранителната среда се оценява чрез анализ на хемилуминесценция. Тестовете бяха проведени в четири екземпляра. Данните са представени като средно ± se, а звездичките показват статистически значими разлики (P

Усещане за гломерулно възпаление in vitro от сензорни клетки: Кросоувър проучване. Сензорните клетки бяха изложени за 24 часа на 1: 1 разредена (50%) среда, кондиционирана с изолирани нормални или нефритни гломерули, изложени на анти-Thy 1 гломерулонефрит (ден 4). Културните среди бяха събрани и подложени на SEAP анализ. Тестовете бяха проведени в четири екземпляра. Данните са представени като средна стойност ± една звездичка показва статистически значима разлика от безусловната среда (контрола), а двойна звездичка показва статистически значима разлика от "нормалната" кондиционирана среда.

Изображение в пълен размер

Постепенна оценка на гломерулонефрит in vivo. Сензорни клетки (1 х 106 клетки) се инжектират в лявата бъбречна артерия на нормални плъхове или нефритични плъхове, които са претърпели анти-Thy 1 гломерулонефрит (ден 1). Плъховете бяха разделени на четири групи: нормални плъхове (група A, n = 5), нормални плъхове, инжектирани със сензорни клетки (група B; n = 4), нефритични плъхове (група C; n = 4) и нефритни плъхове, инжектиран разтвор за инжекция. сензорни клетки (група D; n = 5). Преди и след инжектиране на клетки, серумите се събират на всеки 2 до 3 дни и се подлагат на SEAP тест. За да се определи дали сензорните клетки възприемат само локалното възпаление, където са разположени клетките, 1 x 106 сензорни клетки (група E; n = 4) се инжектират интраперитонеално интраперитонеално и се проследяват серумните нива на SEAP. до 9 дни. Данните са представени като средно ± se, а звездичките показват статистически значими разлики (P

Получаване на сензорни клетки от изолирани гломерули. В края на експериментите (ден 10) гломерулите бяха изолирани от двата бъбрека на нестероидни плъхове, предавани от сензорни клетки и култивирани в присъствието на 10% FBS. Нефритни (-), нефритни гломерули без сензорни клетки; нефритни (+), нефритни гломерули, предавани от сензорни клетки. Гломерулите, изолирани от неинжектирани нормални плъхове (нормални (-)) бяха използвани като отрицателна контрола. Растящите клетки бяха избрани с G418 (330 ug/ml) за 1 до 2 седмици, фиксирани с 1% формалдехид и оцветени с хематоксилин, за да се визуализират устойчиви на неомицин сензорни клетки.

Изображение в пълен размер

За да определим дали нивото на SEAP в серума, предаван от сензорни клетки, е нефритичен плъх, намален чрез терапевтична намеса, използвахме противовъзпалително лекарство, циклофосфамид. При плъхове интраперитонеалното инжектиране на циклофосфамид (165 mg/kg телесно тегло) причинява значително потискане на гломерулното възпаление и протеинурията при експериментален гломерулонефрит. 20 плъха са получили интраперитонеална инжекция с циклофосфамид 2 дни преди инжектирането на сензорни клетки. След 3 дни (Thy 1 гломерулонефрит, ден 2), серуми бяха събрани от лекувани с нефрит и третирани с нефрит нефритни плъхове и подложени на SEAP теста. Както е показано на Фигура 7, приложението на циклофосфамид значително отслабва нарастването на серумния SEAP при клетъчни нефритни плъхове (кратно увеличение на серумния SEAP: 1,81 ± 0,50 пъти при третираните с циклофосфамид плъхове спрямо 3,46 ± 0,44 пъти за нетретираните циклофосфамиди ). плъхове, Р

В това проучване подобрителният елемент на KB се използва като сензор за гломерулно възпаление. Въпреки това, други сензорни последователности, комбинирани със SEAP репортерната система, могат да бъдат полезни за проследяване на гломерулонефрит in vivo. Възможни кандидати за чувствителни към възпаление последователности са SRE и 12-о-тетрадеканоилфорбол-13-ацетатен отговорен елемент (TRE). Ние трансфектирахме мезангиалните клетки с експресионни плазмиди, които въвеждат SEAP гена под контрола на SRE или TRE. Идентифицирани са и са тествани стабилни клонинги за индукция на SEAP в отговор на стимули, включително серум, тромбоцитен растежен фактор, естер на форбол и IL-1β. И при двата типа сензорни клонинги индукцията на SEAP беше неочаквано ниска. За разлика от сензорните клетки, базирани на KB, които постигат високи нива на индукция на SEAP до 70- до 80 пъти, максималните нива на индукция са само два до три пъти (нашите непубликувани данни). Ниската индукция на SEAP в базирани на SRE и TRE сензорни клетки може да се дължи на относително високи нива на базална активност на тези регулаторни елементи и/или ниска индуцируемост в отговор на стимули в култивирани мезангиални клетки.

Използвахме SEAP като молекула-репортер, за да определим гломерулното възпаление. Доколкото ни е известно, това е първото, което демонстрира полезността in vivo на системата за докладване на SEAP за оценка на локалното възпаление. Серумната SEAP активност може да се измери лесно, бързо и чувствително, като се използват конвенционални хемилуминесцентни методи. Това е голямо предимство на репортерската система на SEAP. Един недостатък на in vivo системата за докладване на SEAP е, че SEAP не се екскретира с урината.8 и не е възможна оценка на активността на базата на урина. Това е така, защото молекулярното тегло на SEAP е приблизително 64 kDa, 5, което е твърде голямо, за да се филтрира през гломерулната базална мембрана. Други по-малки молекули-репортери, като човешки хорионгонадотропин, могат да бъдат използвани за наблюдение на локалната активност на заболяване, основано на пикочните пътища, 27 но ще са необходими допълнителни изследвания.

Благодаря

Тази работа беше подкрепена от Безвъзмездни средства за научни изследвания на Министерството на образованието, културата, спорта, науката и технологиите, Япония (16390243 до MK).