лептин

  • елементи
  • абстрактно
  • цели:
  • методи:
  • резултатите:
  • заключение:
  • Въведение
  • Материали и методи
  • Субекти и човешки гастродуоденални биопсии
  • звяр
  • Телосложение
  • Тестове за орален глюкозен толеранс
  • Биохимични параметри на кръвта
  • Хистологични и имунохистохимични изследвания
  • In vivo ефекти на лептина върху нива иРНК Tph1 а Pax4
  • Количествен PCR анализ в реално време
  • Радиоимуноанализ за лептин и инсулин
  • Съдържание на дуоденална лигавица на 5HT чревни LEPR-B KO мишки ( IECLEPR-B KO)
  • Статистически анализ
  • резултатът
  • Повишена експресия на стомашен лептин при индивиди със затлъстяване
  • MRNA TPH1 а PAX4 са увеличени при антрални биопсии на затлъстели индивиди
  • Повишеният стомашен лептин предшества плазмения лептин (производство на адипоцити) при мишки, хранени с HFD
  • EC номер и ниво Pax4 иРНК се увеличават при мишки преди началото на затлъстяването
  • Нива иРНК Pax4 намаляване на липсата на лептин и увеличаване след перорално приложение на лептин
  • дискусия

елементи

  • Клетъчна сигнализация
  • Затлъстяване
  • патогенеза

абстрактно

цели:

По отношение на затлъстяването, докато хиперлептинемията е силно корелирана с излишните мазнини, състоянието на стомашния лептин остава неизвестно. Тук изследвахме експресията на лептин при стомашни биопсии на затлъстели хора и анализирахме временните промени в експресията на стомашен лептин в отговор на затлъстяването, предизвикано от диетата, и неговия ефект върху 5-хидрокситриптамин (5НТ) продуциращи клетки.

методи:

Ентерохромафиновите (EC) клетки и експресията на лептин, PAX4 (критичен фактор за EC спецификация), триптофан хидроксилаза-1 (TPH1, ензим, ограничаващ периферната скорост за 5HT) и 5HT бяха изследвани чрез имунофлуоресценция, количествена PCR в реално време, радиоимуноанализ и стомашна биопсия дванадесетопръстник от 19 затлъстели и 14 нормално претеглени индивида и в остъргване на лигавицата от затлъстели мишки, индуцирани от диета C57B16/J, затлъстели мишки с дефицит на лептин и мишки с дефицит на изоформа на лептинов рецептор В, които имат специфичен характер.

резултатите:

Въпреки че хиперлептинемията при индивиди със затлъстяване, както и при животински модели на затлъстяване корелира с увеличената маса, произвеждаща лептин мазнини, стомашният лептинов статус остава да бъде определен. В това проучване първо изследвахме експресията на лептин в проби от стомашна биопсия от индивиди със затлъстяване и не-затлъстяване и след това анализирахме временните промени в експресията на стомашен лептин при мишки по време на диета с високо съдържание на мазнини (HFD).

В рамките на централната нервна система няколко проучвания съобщават, че зависимият от лептин 5-хидрокситриптамин (5НТ; известен също като серотонин) регулира апетита, 22, 23, 24, докато други съобщават, че лептинът няма пряк ефект върху 5НТ невроните на централната нервна система неврони. нервна система за въздействие върху апетита., 25, 26, 27

Тъй като по-голямата част от 5HT (95%) от организма се произвежда от ентерохромафинова (EC) клетка в червата (главно в антрума и дванадесетопръстника) и тъй като 5HT, получен от червата, не преминава през кръвно-мозъчната бариера и се предполага че 28 определят дали може да съществува стомашен лептинов път - 5НТ. За тази цел, по време на развитието на затлъстяване, ние изследвахме броя на EC клетките в антралната лигавица заедно с експресията на триптофан хидроксилаза-1 (TPH1), ензим, ограничаващ периферната скорост на 5HT, 29 и Pax4 иРНК продукция, критична транскрипция. коефициент за спецификация на EC клетки. 30

Материали и методи

Субекти и човешки гастродуоденални биопсии

Поради малкото налични лица, които не са със затлъстяване, е получена биопсия от лица с нормално тегло, които са били подложени на ендоскопия за диагностика. Всички тези субекти са дали писмено информирано съгласие за горна ендоскопия и всички са имали нормална ендоскопия и нормална стомашна лигавица, потвърдени от рутинен хистологичен анализ. По време на ендоскопското изследване са взети биопсични проби от дъното и антралната част на стомаха и от дванадесетопръстника. Някои бяха използвани за класическо хистологично изследване, а други незабавно бяха замразени в азотна течност и съхранявани при -80 ° C, докато се използват за извличане на обща РНК и протеини.

C57BL/6J мишки, ob/ob на 6-8 седмична възраст (Elevage Janvier, Le Genest-St-Isle, Франция) бяха настанени в отделни клетки в клетки за животни (12:12 светло/тъмно, 21 ° C) с безплатно достъп до вода. Хранени са със стандартна диета (нормална диета (ND), 2900 калории g -1), съдържаща 3% мазнини, 48% сложни въглехидрати първично нишесте и 16% протеин или HFD (4400 калории g -1), съдържащи 45% мазнини, 35% въглехидрати и 20% протеин (C1090-45, Genestil, Altromin Royaucourt, Франция). Консумацията на храна се измерва и телесното тегло се определя два пъти седмично в продължение на 12 седмици.

Телосложение

Обезмаслената маса и чистата маса (представляваща вода и протеини) се определят чрез двойна рентгенова абсорбционна енергия с помощта на инструмент Piximus (GE Lunar Prodigy Corporation), както е описано по-горе. 31 мишки са изследвани преди и след 1 и 12 седмици от началото на диетичната интервенция.

Тестове за орален глюкозен толеранс

Мишките са гладували 16 часа при орална доза от 2 g глюкоза на kg телесно тегло. Образците на кръвна кръв от опашката се оценяват с помощта на глюкометър (Accu-Chek; Roche Diagnostics, Meylan, Франция) преди и 15, 30, 60 и 120 минути след натоварване с глюкоза и се изчисляват площите под кривата (AUC 0-120 минути) .

Биохимични параметри на кръвта

Дванадесет седмици след диетата мишките се упояват; кръв се събира за нива на глюкоза, триглицериди, общ и липопротеинов холестерол с висока плътност, аланин аминотрансфераза и аспартат аминотрансфераза. Тези параметри бяха измерени с автоматичен анализатор AU400 (Olympus Diagnostics, Rungis, Франция). Плазмените нива на лептин и инсулин при мишки се определят с помощта на комплекти за радиоимуноанализ от Linco Research Inc. (Лабодия, Франция). След жертването стомахът и дванадесетопръстника бяха отстранени и разделени на две части: едната за лигавичните секции, а другата за хистологичен, имунохистохимичен и имунофлуоресцентен анализ.

Хистологични и имунохистохимични изследвания

Накратко, вградените в парафин 10% неутрални фиксирани с формалин базални биопсии, миши стомах и дуоденални тъкани бяха разделени на 5 μm и използвани за рутинна хистология и имунореактивно оцветяване, както беше описано по-горе. 7 След обезпаразитяване и хидратация срезовете бяха предварително обработени с 3% H 2 O 2 в продължение на 10 минути при стайна температура и антителата бяха инкубирани една нощ при 4 ° С във фосфатно буфериран физиологичен разтвор, съдържащ говежди серумен албумин). За изследвания на имунофлуоресценцията серийните секции бяха инкубирани със заешко 5НT антитяло (серотонин), разредено 1: 10 000 (Immunostar, Hudson WI, USA) и кози анти-заешки вторични антитела Alexa 488 Fluor IgG (молекулярни сонди; Invitrogen, Saint Aubin, Франция). Броят на 5НТ-положителните клетки се определя количествено чрез преброяване в най-малко пет добре ориентирани антрални жлези (20x) на животно (четири животни на група), използвайки софтуер за анализ на изображението Calopix (TRIBVN, Chatillon, Франция). Резултатите се изразяват като броя на епителните клетки на жлеза.

In vivo ефекти на лептина върху нивата на иРНК Tph1 и Pax4

На осемнайсетчасови гладни мишки е прилаган буфериран с фосфат физиологичен разтвор (контрол) или 0,2 μg миши лептин на g телесно тегло дневно в продължение на 7 дни. На 8-ми ден те бяха упоени, кръвта беше събрана, центрофугирана и плазмата беше съхранявана при -20 ° C. Мишките бяха умъртвени, стомахът и дванадесетопръстника бяха отворени, изплакнати два пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор и лигавицата беше бракувана и незабавно замразена в течност азот и се съхранява при -80 ° C, докато се използва за извличане на обща РНК за количествен PCR анализ в реално време.,

Количествен PCR анализ в реално време

Общата РНК се извлича от биопсии и лигавица от стомаха, дванадесетопръстника, като се използва реактив Trizol (Invitrogen, Saint Aubin, Франция). Количествената PCR в реално време се извършва на Light Cycler System 480 (Roche Diagnostics), както е описано 32, като се използват специфични праймери: за мишка Tph1 (NM_001276372.1), мишка Pax4 (NM_001159925.1); човешки PAX4 (NM_006193.2) и човешки TPH1 (NM_004179.2), всички синтезирани от Eurogentec (Angers, Франция). Данните бяха анализирани, както е описано по-горе. 32

Радиоимуноанализ за лептин и инсулин

Хомогенатите бяха получени от проби от замразени основни биопсии в Krebs-Ringer-HEPES (1 mg mL -1), съдържащи протеазни инхибитори (Sigma Chemicals, Сейнт Луис, МО, САЩ) с тефлонов стъклен хомогенизатор. Хомогенатите се центрофугират при 10 000 g в продължение на 10 минути. Лептинът се определя в тъканни хомогенати и плазма, като се използва човешки комплект за радиоимуноанализ на лептин от Linco Research Inc. Количествено се определя инсулинът в плазмата, като се използва радиоимунологичен комплект за миши инсулин. 33

Съдържание на лигавицата на дванадесетопръстника на 5HT чревни LEPR-B KO мишки (IEC LEPR-B KO)

Мишки от див тип и IEC LEPR-B KO на възраст 6 до 8 седмици бяха настанени в цикъл 12:12: тъмна светлина и снабдени с храна и вода ad libitum. Мишките, които са гладували през нощта, са умъртвени и след лапаротомия дванадесетопръстникът е бързо отстранен, изплакнат със студена вода и лигавицата се изхвърля веднага след замразяване в течен азот и се съхранява при -80 ° C до употреба. буфериран физиологичен разтвор с помощта на стъклен хомогенизатор върху лед. Хомогенатите се центрофугират при 5000 g в продължение на 10 минути. Супернатантите бяха събрани и използвани за определяне на 5НТ с помощта на ензим за имуноанализ на 5НТ (Abnova Corporation, Тайван).

Статистически анализ

Резултатите са изразени като средно ± sem. В зависимост от видовете сравнение, непараметричният тест на Ман-Уитни или еднопосочен дисперсионен анализ с Tukey-Kramer бяха извършени множество сравнителни тестове след използване на GraphPad Prism версия 5.00 за Windows, (GraphPad Software Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ ). Стойността P 20 на 34 пациенти със затлъстяване със значително увеличен плазмен лептин (Фигура 1в) и общ грелин е използвана като гранична стойност за статистическа значимост, докато нивата на циркулиращ PYY са значително намалени в сравнение с слабите индивиди. (данните не са показани). При затлъстели индивиди нивата на LEP mRNA на лигавицата на лигавицата са се увеличили 5 пъти, а нивата на лептин протеин са 2 пъти по-високи (Р

Стомашният лептин се е увеличил при затлъстели в сравнение с бедни индивиди. Общата РНК или протеини бяха извлечени от фундаментални биопсии на кандидати за бариатрична хирургия със затлъстяване и бедни индивиди и използвани за определяне на нивата на лептин mRNA ( а ) и протеини ( б ). Нивата на лептин, произведен от адипоцити, са изследвани в кръвта на същите индивиди ( ° С ). TPH1 нива на иРНК ( д ) и PAX4 ( д ) при антрални биопсии на затлъстели и бедни индивиди. Резултатите са представени като данни за дисперсия със средно, Р е определено чрез непараметричен тест на Ман-Уитни.

Изображение в пълен размер

MRNA TPH1 и PAX4 са повишени при антрални биопсии на затлъстели индивиди

Нивата на тРНК mPHK от антрални биопсии на затлъстели индивиди (Фигура 1d) са били два пъти по-високи (1, 75–2, 73, 95% доверителен интервал (CI)) в сравнение с (0,38–0,67, 95% CI);

Характеристики на мишки, хранени с нормална диета (ND) и диета с високо съдържание на мазнини (HFD). Прием на калории ( а ), качване на тегло б ), плазмена глюкоза ( ° С ), триглицериди, д ) холестерол ( д ) и нива на липопротеин с висока плътност на холестерола ( е ) бяха изследвани при мишки, хранени с ND или HFD в продължение на 3 месеца. Данните са изразени като средно ± sem или като полета и мустаци. Стойността на Р се определя чрез двупосочен дисперсионен анализ за сравняване на времевия ход на получената маса и теста на Ман-Уитни за останалите данни. NS, незначително.

Изображение в пълен размер

Ранно и съпътстващо повишаване на нивата на инсулин в кръвта и на стомашния лептин преди началото на затлъстяването. Плазмен инсулин ( а ), стомашен лептин ( б ), телесни мазнини ( ° С ) и плазмен лептин, произведен от адипоцити ( д ) бяха определени при мишки, хранени с ND или HFD за 7, 14, 28 и 92 дни. Данните са изразени като средна стойност ± sem, статистическа значимост * P 20

Броят на EC клетките и нивата на рРНК Pax4 се увеличиха при мишки преди началото на затлъстяването

За да изследваме дали съдържанието на 5НТ в стомаха и дванадесетопръстника следва същото нарастване по време на HFD, както в съдържанието на стомашен лептин, ние проведохме проучвания с имунофлуоресценция с 5НТ на антрални и дуоденални участъци от 1-седмични ND и HFD-хранени мишки. Както е показано на Фигура 4, броят на 5НТ-положителните клетки е по-висок в антралната и дванадесетопръстника на HFD-, отколкото в клетките на мишки, хранени с ND. Освен това, увеличен брой EC клетки (Фигура 4b) е свързан с повишени нива на Pax4 mRNA в антрала (1,5 пъти; P

Броят на EC клетките и нивата на иРНК Pax4 се увеличиха в антралната част на мишки, хранени с HFD за 7 дни. ( а ) Представителни микрофотографии на 5НТ-положителни клетки (EC клетки) в антралната част на мишки, хранени с ND (ляв панел) и HFD (десен панел) за 7 дни. б ) Количествено определяне на ES клетки, изразено като брой ES клетки на жлеза. ( ° С ) Pax4 нива на иРНК в антралната и дуоденалната лигавица на мишки, хранени с ND и HFD в продължение на 7 дни. Резултатите бяха средни ± sem, n = 4 мишки във всяка група и групите бяха сравнени с помощта на непараметричния тест на Ман-Уитни.

Изображение в пълен размер

Нивата на иРНК Pax4 намаляват при недостиг на лептин и се увеличават след перорално приложение на лептин

За да определим дали промените в нивата на Pax4 могат да бъдат частично свързани с промените на лептина, ние анализирахме нивата на Pax4 mRNA в антралната и дуоденалната лигавица на мишки с дефицит на лептин ob/ob. ob/ob мишки показаха значително намаляване на Pax4 иРНК (50%, Р

Интересното е, че установихме, че индуцираната от HFD свръхекспресия на стомашен лептин е придружена от увеличен брой 5HT-съдържащи EC клетки както върху предната, така и върху дуоденалната лигавица. Тези данни са в съответствие с резултатите, които показват, че мишките, хранени със западна диета, имат повишена наличност на 5НТ в тънките черва. В рамките на GI системата 5НТ се произвежда най-вече в епителните клетки на ЕС и се среща и в невроните на ентералната нервна система. 42 5HT, произведен в периферията, не навлиза в мозъка 29, което ограничава неговите биологични ефекти извън мозъка, въпреки че някои хипоталамусни неврони могат да бъдат достъпни. В мозъка, въпреки че ролята на 5НТ в медиирането на ефекта на лептина върху регулирането на енергийната хомеостаза се медиира от 5НТ, той е широко проучен, но неговите ефекти все още са противоречиви. 24, 26 Този проблем никога не е разрешен в стомашно-чревния тракт, където се произвеждат както лептин, така и 5НТ. Съобщава се, че мишките с липса на 5HT повторно поемане (SERT), които показват хиперлептинемия и значително увеличение на церебралните 5HT, 43, развиват глюкозна непоносимост, инсулинова резистентност и затлъстяване въпреки намаления прием на храна. 44

В този доклад установихме, че при индивиди със затлъстяване, периферният ограничаващ скоростта ензим 5HT, TPH1 и транскрипционният фактор PAX4 са увеличени. Pax4 е критичен за определянето на EC клетки, тъй като тези клетки напълно липсват при мишки с дефицит на Pax4. 30 Ние вярваме, че лептиновият път играе роля в спецификацията на EC клетъчната линия, тъй като (i) броят на EC клетките е намален в тънките черва на затлъстели db/db мишки с дефицит на лептинов рецептор, 45 (ii) мишки с дефект в LEPR-B сигнализирането в чревните епителни клетки има намалено съдържание на 5НТ и (iii) перорално лечение на мишки с лептин (имитиращо стомашен лептин) увеличава Pax4 в антрума и дванадесетопръстника. Ролята на лептина в контрола на клетъчната диференциация вече се предполага в ембрионалните невроепителни клетки, тъй като поддържа невронни предшественици и благоприятства развитието на глията и невроните в ембрионите. 46 Освен това е показано, че лептинът индуцира експресията на неврогенин-1, -2 и NeuroD1/BETA 2, три bHLH транскрипционни фактора, които също участват в спецификацията на ентероендокринните клетки.

Понастоящем се появяват доказателства, че освобождаването на 5НТ от клетките на ЕС в отговор на луминални хранителни вещества играе важна роля в развитието на чревно възпаление. 47, 48, 49 Също така се признава, че затлъстяването е свързано с нискостепенно хронично възпаление. Наскоро се предполага, че чревното възпаление може да бъде ранна последица от HFD, което допринася за затлъстяването и свързаната с него инсулинова резистентност. Въпреки че механизмите, лежащи в основата на ранното чревно възпаление, свързано със затлъстяването, не са напълно дефинирани, те ясно включват чревни микробиотици. След сигнала за лептин, ранното повишаване на нивата на 5HT в червата, наблюдавано по време на HFD, може също да участва в индуцирането на чревно възпаление и затлъстяване; това обаче все още трябва да бъде ясно демонстрирано.

Накратко, това е първата демонстрация, че стомашният лептин е увеличен при затлъстели индивиди и че свръхекспресията е настъпила преди появата на затлъстяване, преди разширяването на мастната маса и при увеличаването на лептина, произведен от адипоцитите при мишки. От данните предполагаме, че повишеното регулиране на стомашния лептин по време на HFD-индуцирано затлъстяване може да представлява механизъм за адаптация на чревните епителни клетки към висококалорични входове, които биха могли да допринесат за разширяване на мазнините и затлъстяване. Съществуването на произведен от „лептин-5НТ” чревен тракт може да влоши ефекта от тази висококалорична диета.